论文部分内容阅读
目的:肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）和血管周围炎症是促肺动脉高压（PAH）疾病发展的关键因素。PAH的病理生理学特征是PASMCs过度增殖引起肺血管重构,缺氧是造成PAH的主要诱因。目前PAH的潜在机制仍不清楚。长链非编码RNA（lnc RNA）是许多病理生理过程的关键调节因子,包括但不限于细胞功能调节、免疫和炎症反应以及血管生成。关于lnc RNA异常表达水平与PAH发生发展关系的深入的机制研究仍较少。尿路上皮癌相关蛋白1（UCA1）作为一种新型lnc RNA,因其在细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、转移中的重要作用,已被视为一种具有潜能的靶点基因。现有研究已表明了UCA1在PAH发展中的作用,且进一步研究发现经AKT/m TOR途径激活可促进了PASMCs的增殖AKT/m TOR信号通路的下调在抑制细胞增殖,减少肺血管重塑中起重要作用。目前研究已证实了UCA1在各种疾病中的作用,以及AKT/m TOR信号通路在肺血管重塑中的作用。然而,UCA1对PAH的影响尚不清楚,在PAH的研究中,UCA1与AKT/m TOR信号通路的相互作用也很少。因此,通过本论文的研究,我们将深入认识Lnc RNA UCA1在低氧诱导下PASMCs表型转化中的作用及其机制研究,进而为PAH治疗提供新的靶点。方法:本研究中通过q RT-PCR测定UCA1在大鼠健康组织和PAH组织中的表达。Western blot检测UCA1对AKT/m TOR信号通路的影响以及pAKT,AKT,p-ERK,ERK,p-m TOR,m TOR的表达。流式细胞术、MTT和Brd U分析分别用于研究细胞周期,生存能力和细胞增殖。此外,通过western blot分析了与细胞周期相关的蛋白质,例如CDK4,CDK6,cyclin A2,cyclin D1和cyclin E。划痕愈合分析和transwell实验用于测量细胞迁移。结果:⑴建立的肺动脉高压SD大鼠模型经3周时间后,肺动脉平均压超过25mm Hg,与对照组、基线组和1周组肺动脉平均压相比均表现出显著差异（P<0.05）,结果表明造模成功,达到PAH的诊断标准;⑵在激光共聚焦荧光显微镜下,培养的PASMCs对平滑肌α-actin免疫荧光显色呈阳性反应,在PASMCs胞质中可见棕红色荧光显色的肌动蛋白,并且肌丝与PASMCs长轴平行排列;⑶PAH条件下肺组织和肺小动脉组织中UCA1与正常组织相比均上调（P<0.01）。低氧条件下UCA1的表达随治疗时间的增加而表达上调（P<0.01）。相对UCA1,si-UCA1-1（P<0.01）和si-UCA1-2（P<0.05）表达均明显下调;⑷低氧条件时细胞活力高于常氧条件（P<0.01）。与空白组和si-NC组相比,缺氧条件下的细胞活力被上调,而UCA1表达下调降低了细胞的相对活力（P<0.01）。与空白组和si-NC组相比,缺氧条件下si-UCA1-1中的阳性细胞数减少;⑸与si-NC组和空白组的细胞相比,缺氧条件下细胞在G0/G1期的比例增加,而si-UCA1-1组的S期细胞比例降低,但空白组与si-NC细胞周期无显着性差异。与常氧条件相比,缺氧条件下空白组,si-NC组中cyclin D1表达均明显上调（P<0.01）。与空白组相比,缺氧条件下si-UCA1-1组cyclin D1相对表达下调。此外,与常氧条件相比,cyclin E1在缺氧条件下明显上调,cyclin A2相对表达无变化（P>0.05）;⑹在缺氧条件下,空白组和si-NC组细胞的迁移能力明显高于常氧条件。同时,si-UCA1-1能显著抑制常氧及缺氧条件下的迁移能力;⑺缺氧条件下空白组和si-NC组细胞中p-AKT,p-ERK,p-m TOR,CDK4和CDK6的表达水平高于常氧条件。同时,在常氧、缺氧条件下,si-UCA1-1可显著抑制上述蛋白的表达（P<0.01）,但在常氧和低氧条件下,si-NC组和空白组之间无明显差异（P>0.05）;⑻与对照组和空白组相比,p-UCA1增强UCA1的相对表达（P<0.01）,但periposine对UCA1的相对表达没有影响。且Periposine无抑制p-UCA1的作用。p-UCA1可以提高p-AKT/AKT的相对值（P<0.01）,而periposine可以抑制p-AKT/AKT的相对值（P<0.01）。与p-UCA1组相比,perifosine与pUCA1联合使用可抑制p-AKT/AKT的相对值（P<0.01）。periposine比空白对照明显抑制细胞活力,而p-UCA1明显增强了细胞活力,p-UCA1联合periposine可将细胞活力调节至正常水平;⑼在p-UCA1组中,G0/G1的细胞数低于空白组和对照组（P<0.05）。periposine组细胞G0/G1（%）高于空白组和对照组（P<0.05）。同时,p-UCA1与periposine联合可将G0/G1（%）细胞数调节至正常水平。p-UCA1可以显提高细胞的迁移距离和细胞数量（P<0.01）,而periposine可以抑制细胞迁移（P<0.01）。p-UCA1联合periposine可以调节细胞迁移距离和数量至正常水平。结论:⑴Lnc RNA UCA1参与了缺氧诱导的PASMCs表型转化进程;⑵Lnc RNA UCA1增强低氧诱导PASMCs的活力、增殖和迁移;⑶Lnc RNA UCA1激活AKT/m TOR信号通路增强缺氧诱导的PASMCs表型转化进程。综上所述,Lnc RNA UCA1-AKT/m TOR调控途径是低氧诱导下PASMCs表型转化的重要调控机制,UCA1有望成为PAH治疗新的靶点。