论文部分内容阅读
目的:骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic Syndromes,MDS）是一种造血干细胞恶性克隆性疾病。主要发病机制是患者体内恶性克隆细胞增多和细胞免疫耐受。MDS患者体内调节性T细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）的免疫调节功能亢进,IL-10、TGF-β等细胞因子的表达增加,以及高表达免疫检查点蛋白（ICP,如PD-1、TIM3、CTLA-4等）均可导致机体细胞免疫耐受。PD-1和CTLA-4抑制剂已被批准应用于临床,但在对PD-1抑制剂耐药的患者中检测到了T细胞免疫球蛋白粘液素3（TIM3）的表达增高,并且有研究报道了在高危MDS患者中联合应用TIM3抑制剂获得了50%的缓解率[1],使得TIM3与细胞免疫耐受的关系备受关注,而MDS患者体内CD8+T细胞与TIM3的关系尚不明确。本研究检测分析CD8+T细胞和MDSCs在MDS患者中的功能状态,TIM3及其配体半乳凝素9（Gal-9）的表达情况,分选CD8+T细胞和MDSCs体外共培养,同时检测阻断TIM3/Gal-9通路后CD8+T细胞的功能及凋亡变化,阐明TIM3/Gal-9通路在MDSCs诱导CD8+T细胞“耗竭”中的作用,力图恢复“耗竭”的CD8+T细胞杀伤功能,为MDS的免疫靶点治疗提供新的理论依据。方法:本课题总共纳入2016年10月至2020年1月在天津医科大学总医院血液内科新诊治的110例MDS患者及73名正常对照者。第一部分流式细胞术检测MDS患者和正常对照者（NC）体内CD3+CD8+T细胞的比例,检测CD8+T细胞的干扰素-γ（INF-γ）、TIM3、穿孔素（Perforin）、颗粒酶B（Granzyme B）、CD95的表达情况。第二部分流式检测MDS患者和对照者体内MDSCs上Gal-9的表达,流式分选MDS患者和对照者骨髓中的MDSCs,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测MDSCs上Gal-9,细胞因子IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α在m RNA水平的表达情况,并体外培养MDSCs,采用Elisa方法检测MDSCs培养上清中Gal-9、IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α的浓度,以IL-10/IL-12,TGF-β/TNF-α的比值来评估MDSCs的极化方向,并收集MDS患者的临床资料与MDSCs的细胞因子分泌情况做相关性分析。第三部分CD8+T细胞和MDSCs或外源性Gal-9体外共培养,探索MDSCs或外源性Gal-9是否对CD8+T细胞有抑制作用。磁珠分选MDS患者和对照者骨髓及外周血CD8+T细胞,流式细胞术分选MDS患者骨髓及外周血的MDSCs,并检测分选纯度;采用流式检测CD8+T细胞单独培养组、CD8+T细胞+MDSCs（1:2）共培养组、CD8+T细胞+MDSCs+TIM3阻断剂共培养组、CD8+T细胞+MDSCs+Gal-9阻断剂共培养组、CD8+T细胞+MDSCs+TIM3/Gal-9双阻断剂共培养组五组培养体系中CD8+T细胞的功能因子Perforin和Granzyme B的表达情况,凋亡试剂盒检测CD8+T细胞的凋亡情况,CFSE方法检测CD8+T细胞的增殖情况;采用流式检测CD8+T细胞单独培养组、CD8+T细胞+过量外源性Gal-9共培养组、CD8+T细胞+过量外源性Gal-9+TIM3阻断剂共培养组、CD8+T细胞+过量外源性Gal-9+Gal-9阻断剂共培养组四组之间CD8+T细胞的功能因子Perforin和Granzyme B的表达情况,并采用蛋白质印迹法（Western Blot,WB）检测培养后CD8+T细胞中穿孔素、颗粒酶B分泌相关蛋白Notch1、EOMES以及生长增殖相关蛋白p-m TOR、p-AKT的表达情况。第四部分我们发现初治MDS患者CD8+T细胞“耗竭”与TIM3/Gal-9通路有关,对于治疗后的患者我们进一步探索其CD8+T细胞中TIM3/Gal-9通路的活化情况。应用流式检测MDS患者应用地西他滨（Decitabine,DAC）治疗前后CD8+T细胞上TIM3和Gal-9的表达。结果:第一部分MDS患者CD8+T细胞的数量和功能分析（1）MDS患者的外周血中CD3+CD8+T细胞占外周血单个核细胞（PBMC）的百分比明显低于对照组（17.97±8.47%vs.26.35±8.30%,P=0.0355）,根据IPSS评分高危组（IPSS>1）MDS（high-risk MDS）患者CD3+CD8+T细胞%略少于低危组MDS（low-risk MDS,IPSS≤1）,但没有统计学差异（16.05±9.75%vs.20.07±9.12%,P=0.5217）。（2）MDS患者CD3+CD8+T细胞分泌功能因子INF-γ明显少于对照组（15.05±9.20%vs.25.5±11.4%,P=0.0039）,高危组与低危组之间没有明显的统计学差异（15.0±8.07%vs.15.11±10.52%,P>0.05）。（3）MDS患者CD8+T细胞上TIM3表达明显高于对照组（TIM3+CD3+CD8+T cells/CD3+CD8+T cells=22.06（15.77-30.41）%vs.11.55（6.78-15.13）%,P=0.0013）,低危组和高危组之间没有差异（21.82（17.14-27.12）%vs.26.29（12.04-34.25）%,P>0.05）。MDS患者中TIM3+CD8+T细胞比MDS组及NC组中TIM3-CD8+T细胞高表达CD95（P=0.0014）,低表达Perforin（P=0.0106）和Granzyme B（P=0.0129）。第二部分MDSCs细胞功能状态分析（1）MDS患者MDSCs（MDS-MDSCs）上Gal-9的表达明显高于对照组（NC-MDSCs）（17.21%（8.74%-35.77%）vs.2.61%（1.19%-3.39%）,P<0.0001）,高危组和低危组均高于对照组,但低危组和高危组之间没有统计学差异（16.86%（7.15%-39.19%）vs.20.72%（10.74%-36.35%）,P=0.7148）;MDS患者MDSCs上Gal-9 m RNA的相对表达量也明显高于对照组（3.49（2.09-12.57）vs.0.99（0.50-2.50）,P<0.05）;Gal-9在高危和低危MDS的骨髓上清、血清、MDSCs体外培养上清中的浓度均高于对照组,高危组和低危组MDS之间没有统计学差异（骨髓上清（high-risk MDS vs.low-risk MDS vs.NC）:323.6±42.6 pg/m L vs.381±55.98pg/m L vs.154.9±23.72 pg/m L,P=0.0042;血清（high-risk MDS vs.low-risk MDS vs.NC）:194.5±16.13 pg/m L vs.237.1±7.18 pg/m L vs.69.81±11.93 pg/m L,P<0.0001;MDSCs培养上清（MDS vs.NC）:147.7±5.24 pg/m L vs.14.2±0.55 pg/m L,P<0.0001）。（2）高危组MDS-MDSCs中IL-10/IL-12,TGF-β/TNF-αm RNA相对表达量的比值高于NC-MDSCs组,高危组MDS-MDSCs培养上清中IL-10/IL-12浓度比值高于NC-MDSCs组,TGF-β/TNF-α浓度比值没有明显的统计学差异,低危组MDS-MDSCs与NC-MDSCs组之间均无差异（高危组:低危组:NC组:IL-10/IL-12 m RNA:20.2（8.54-75.12）vs.5.13（2.23-25.63）vs.1.80（0.33-8.93）,P=0.0145;TGF-β/TNF-αm RNA:2.69（1.56-6.35）vs.0.64（0.37-0.99）vs.0.73（0.30-2.79）,P=0.0055;IL-10/IL-12浓度:4.06±1.50 vs.0.23±0.02 vs.0.22±0.01,P=0.0060;TGF-β/TNF-α浓度:4.21（0.66-21.52）vs.7.26（1.46-27.37）vs.3.30（1.54-3.74）,P=0.2569）。（3）MDS-MDSCs中TGF-β/TNF-αm RNA与外周血CD3+CD8+T淋巴细胞比例呈负相关性,与CD3+CD4+T细胞比例和CD4+/CD8+T细胞比值呈正相关性（分别为R2=0.3831,P=0.0423;R2=0.4747,P=0.0132;R2=0.4529,P=0.0233）。调节性T细胞（Treg）在CD4+T细胞中的百分比在高危MDS组、低危MDS组和NC组分别为3.17±0.73%、0.98±0.30%和1.44±0.62%,组间比较:高危MDS组高于NC组（P=0.0345）,低危MDS组与高危MDS和NC组之间无差异（P=0.1456和P=0.8284）。对照组外周血单个核细胞（NC-PBMC）与MDS-MDSCs共培养后Treg%增高（16.03±5.15%vs.9.79±3.36%,P=0.0305）。（4）IL-10/IL-12 m RNA和TGF-β/TNF-αm RNA比值均与骨髓原始细胞比例呈正相关（IL-10/IL-12:R2=0.2853,P=0.0491;TGF-β/TNF-α:R2=0.4867,P=0.0038）;TGF-β/TNF-αm RNA在中性粒细胞绝对值（ANC）小于等于0.8?109/L的MDS患者中比值明显高于ANC大于0.8?109/L的患者（2.41（0.96-12.83）vs.0.91（0.37-1.38）,P=0.0360）,IL-10/IL-12 m RNA比值间无差异（14.08（4.88-56.87）vs.9.22（3.35-17.59）,P=0.3884）。第三部分TIM3/Gal-9通路在MDSCs抑制CD8+T细胞中的作用研究（1）体外分选MDSCs和CD8+T细胞纯度均为90%以上。和MDS患者MDSCs（MDS-MDSCs）共培养的正常对照组CD8+T细胞（NC-CD8）比NC-CD8单独培养组穿孔素分泌减少（16.02±5.86%vs.22.02±5.96%,P=0.0271）,早期凋亡率增加（38.66±7.91%vs.16.18±3.84%,P=0.0075）,颗粒酶B和增殖无差异（Granzyme-B:20.1%（14.08-37.12%）vs.31.68%（24.17-42.32%）,P=0.0605;增殖:953075（533581-4433061）vs.757364（330311-1596830）,P>0.05）。（2）在MDS患者CD8+T细胞和MDSCs共培养的体系中,CD8+MDSCs共培养组比CD8单独培养组的CD8+T细胞Perforin、Granzyme-B分泌减少（分别为P=0.0001和P<0.0001）,早期凋亡率增加（P=0.0045）,而加入阻断剂后的CD8+MDSCs+TIM3阻断剂（F38-2E2）组、CD8+MDSCs+Gal-9阻断剂（9M1-3）组、CD8+MDSCs+TIM3/Gal9双阻断剂（F38-2E2/9M1-3）组比不加阻断剂的CD8+MDSCs共培养组中CD8+T细胞功能得到部分恢复,Perforin、Granzyme-B分泌增加,早期凋亡率减低（组间比较分别为:Perforin%:P<0.0001,P=0.0001,P=0.0002;Granzyme-B%:P=0.0021,P=0.0050,P=0.0075;早期凋亡率:P=0.0130,P=0.0029,P=0.0071）。（3）MDS-CD8与过量外源性Gal-9共培养组较MDS-CD8单独培养组、CD8+Gal-9+F38-2E2组、CD8+Gal-9+9M1-3组的CD8+T细胞Perforin、Granzyme-B分泌减少（15.33±2.83%vs.21.79±3.35%vs.20.63±3.37%vs.19.01±3.49%,P<0.0001;15.95±5.47%vs.21.32±6.56%vs.20.18±6.44%vs.18.38±6.07%,P=0.0019）。（4）MDS-CD8+Gal-9培养组的CD8+T细胞中与穿孔素、颗粒酶B分泌相关蛋白Notch1、EOMES以及生长增殖相关蛋白p-m TOR、p-AKT的表达较MDS-CD8单独培养组减低（分别为1.7±0.24%vs.5.01±0.98%,P<0.01;26.37±6.65%vs.34.81±7.96%,P<0.05;3.15±0.88%vs.6.44±2.30%,P<0.01;15.78±6.21%vs.25.57±9.73%,P<0.01）。第四部分MDS患者应用地西他滨治疗前后CD8+T细胞上TIM3和Gal-9的表达情况（1）MDS患者体内CD8+T细胞上Gal-9的表达明显高于NC组（15.55±2.01%vs.1.64±0.21%,P<0.0001）。（2）MDS患者在应用一个标准剂量DAC治疗后CD8+T细胞上TIM3的表达高于DAC治疗前（30.51±3.61%vs.23.57±3.24%,P=0.0441）,而Gal-9的表达在DAC治疗前后变化无统计学意义（11.70±6.30%vs.7.26±2.61%,P=0.3709）。（3）DAC治疗敏感组CD8+T细胞上TIM3的表达在第2疗程后表达开始下降（DAC治疗前-1疗-2疗-3疗:29.62%-27.35%-25.25%-23.77%）,DAC治疗耐药组CD8+T细胞上TIM3有上升趋势（DAC治疗前-1疗-2疗:21.27%-35.32%-38.32%）。结论:1.MDS患者CD8+T细胞数量减少,功能减低,呈现耗竭状态,TIM3+CD8+T细胞功能低下,且更容易凋亡。2.MDS患者MDSCs高表达TIM3的配体Gal-9,较高危MDS患者以诱导免疫耐受的M2型MDSCs为主（M1型以促炎因子为主）,且M2-MDSCs与免疫细胞及疾病危险度相关,提示MDSCs可能通过TIM3/Gal-9通路抑制免疫细胞功能。3.CD8+T细胞与MDSCs共培养后杀伤功能相关因子穿孔素、颗粒酶B减少,早期凋亡率增加,加入TIM3/Gal-9通路阻断剂后功能和凋亡均能得到部分恢复。过量的外源性Gal-9也可以明显抑制CD8+T细胞,提示MDSCs可能通过TIM3/Gal-9通路抑制CD8+T细胞的功能,导致CD8+T细胞耗竭,TIM3/Gal-9通路抑制剂可能有助于MDS的细胞免疫靶向免疫治疗。4.MDS患者CD8+T细胞同时高表达Gal-9,表明MDS患者的CD8+T细胞可能通过自分泌途径形成TIM3/Gal-9通路环,加速自身的耗竭。MDS患者随着DAC治疗增加,治疗敏感组TIM3表达有下降趋势,而DAC耐药组TIM3表达则持续增加,DAC耐药可能与CD8+T细胞上高表达TIM3有关。