【摘 要】
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肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae,MP）是一种细菌性人类病原体,是全球公认的导致原发性非典型肺炎的主要病因,能引起上呼吸道症状和下呼吸道疾病。鉴于MP耐药菌株的出现和高发生率,预防MP感染引起的肺炎和继发性并发症的疫苗迫在眉睫。国外曾进行过甲醛的MP灭活疫苗临床试验,保护效果仅在40%左右。本研究采用甲醛和β-丙内酯（BPL）两种灭活剂对MP进行灭活,比较两种灭活剂的灭活效果及
【基金项目】
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国家自然科学基金“青年科学基金”项目（31500011）； 医学科学院与健康科技创新项目（2016-12M-3-026）；
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肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae,MP）是一种细菌性人类病原体,是全球公认的导致原发性非典型肺炎的主要病因,能引起上呼吸道症状和下呼吸道疾病。鉴于MP耐药菌株的出现和高发生率,预防MP感染引起的肺炎和继发性并发症的疫苗迫在眉睫。国外曾进行过甲醛的MP灭活疫苗临床试验,保护效果仅在40%左右。本研究采用甲醛和β-丙内酯（BPL）两种灭活剂对MP进行灭活,比较两种灭活剂的灭活效果及灭活后样品对Balb/c小鼠的免疫保护效果,并进一步探索MP灭活液的免疫剂量、剂次等对动物的免疫效果,对MP疫苗的研究具有重要意义。[目的]用甲醛和BPL制备肺炎支原体灭活液,比较两种灭活剂灭活效果及灭活样品对Balb/c小鼠的免疫效果,并进行免疫剂量和免疫剂次探索对BPL灭活MP的安全性及免疫原性进行研究。[方法]1.双抗体夹心ELISA体系建立:用山羊抗MP多克隆抗体、兔抗MP多克隆抗体和鼠抗MP多克隆抗体三种抗体,两两组合对MP抗原进行双抗体夹心ELISA检测,选取灵敏度高,交叉反应小的抗体建立双抗体夹心ELISA检测体系。2.MP标准品制备:将大量培养的5LMP菌液离心,1000倍浓缩收集,1ml/管分装于-80℃冻存,记为标准品MP-202001。将MP-202001倍比稀释以ELISA测定值大于0.1的最大稀释度的倒数作为其EU含量。将标准品MP-202001进行4倍稀释作为二级标准品（MP-202002）置于-20℃冻存,用于后续实验中MP抗原检测。3.灭活工艺研究:对肺炎支原体的培养进行优化,制备大量MP抗原用。不同浓度的甲醛和β-丙内酯对MP（ATCC 29342）进行灭活处理,测定不同灭活条件下最佳灭活时间,并对灭活样品的蛋白含量和EU等进行测定。4.免疫效果评价:两种灭活剂灭活样品相同蛋白量（20μg）对4-6周龄的Balb/c小鼠进行皮下免疫,用肺炎支原体ATCC 29342以107CCU/ml进行攻毒,通过测定攻毒后肺组织中MP的活菌数计算MP清除率,进行组织病理学评分和测定血清中抗体效价等指标。[结果]1.用山羊抗MP多克隆抗体和兔抗MP多克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA,测定标准品MP-202001的抗原含量为2560 EU/ml。标准品倍比稀释检测所得曲线中,标准品稀释后在10 EU/ml-320EU/ml范围内检测值标准曲线R2>0.97,回归性良好。2.β-丙内酯（BPL）作为灭活剂相比于甲醛灭活的MP样品,在灭活后相同蛋白含量下,BPL灭活的MP样品有效抗原含量（EU）较甲醛灭活的MP样品高,0.05%和0.1%BPL灭活组所含抗原含量要高于甲醛灭活组（p<0.95）,且所需灭活时间更短。相同蛋白含量进行Balb/c小鼠的免疫（20μg/只）,0.1%的BPL灭活的MP样品GMT（1:9.12）、血清IgG抗体水平和对MP的清除率均显著高于甲醛灭活的各组（p<0.001）。3.选取上述灭活条件0.1%BPL进行免疫剂量探索,用不同剂量0.1%BPL灭活的 MP 样品免疫 Balb/c 雌鼠,按 0.675 EU/只、1.35 EU/只、2.7 EU/只、5.4 EU/只、10.8 EU/只、21.6 EU/只、43.2 EU/只剂量免疫小鼠MP的清除率分别为60.7%、80.5%、94.6%、92.7%、92.0%、91.1%、91.4%。结果显示免疫剂量在 2.7 EU/只及以上的各组GMT和血清IgG抗体水平要高于免疫剂量低于2.7 EU/只的组,经统计分析结果具显著性（p<0.05）。0.1%BPL灭活的MP,2.7 EU/只进行免疫剂次探索,对小鼠进行一次、二次、三次、四次、五次免疫小鼠测定血清效价及血清IgG抗体水平显示该灭活样品多次加强免疫后免疫效果要优于单次免疫,结果显示该灭活样品3次及以上免疫的Balb/c小鼠GMT和血清IgG抗体水平明显高于一次二次免疫（p<0.001）,3次及以上免疫的MP清除率可达100%。[结论]1.以山羊抗MP多抗和兔抗MP多抗建立的双抗体夹心ELISA,测定标准品MP-202001的抗原含量为2560EU/ml,标准品稀释在10 EU/ml-320 EU/ml范围内线性回归良好可用于MP的定量检测。2.BPL作为MP抗原的灭活剂要优于甲醛作为MP抗原灭活剂。两种灭活剂灭活后相同蛋白量下BPL灭活样品有效抗原EU高于甲醛灭活样品（p<0.05）。0.1%BPL灭活组免疫Balb/c小鼠后与甲醛灭活各组相比MP清除效果更好（p<0.05）。3.0.1%BPL灭活的MP样品皮下免疫Balb/c小鼠接种量2.7 EU/只免疫3次,用测定活菌含量为107CC U/ml的MP菌液攻毒后,Balb/c小鼠对MP的清除率可达100%。
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