【摘 要】
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[目的]通过建立细胞氧糖剥夺模型,以PI3K信号通路抑制剂LY294002处理PC12细胞,检测不同温度下PC12细胞的凋亡与PI3K蛋白质的表达变化,阐明低温通过PI3K/AKT信号通路对细胞保护的作用机制。[方法]对PC12细胞进行培养,细胞传代培养后,采用连二亚硫酸钠（Na2S204）,联合无糖DMEM的方法建立PC12细胞氧糖剥夺模型,通过CCK-8细胞计数法,IRAK1、TNF-α炎性因
【基金项目】
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云南省应用基础研究（2017FE467-053）； 云南省卫生科技计划项目（2014NS5087）；
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[目的]通过建立细胞氧糖剥夺模型,以PI3K信号通路抑制剂LY294002处理PC12细胞,检测不同温度下PC12细胞的凋亡与PI3K蛋白质的表达变化,阐明低温通过PI3K/AKT信号通路对细胞保护的作用机制。[方法]对PC12细胞进行培养,细胞传代培养后,采用连二亚硫酸钠（Na2S204）,联合无糖DMEM的方法建立PC12细胞氧糖剥夺模型,通过CCK-8细胞计数法,IRAK1、TNF-α炎性因子来评价PC12细胞损伤程度,判断模型构建是否成功。将体外培养的PC12细胞分为9组,3个对照组、3个OGD/R组、3个LY294002组。将对照组、OGD/R组、LY294002组分别放入3个温度段进行培养:①常温组（37℃培养箱培养24h）、②亚低温组（32℃培养箱培养24h）、③深低温组（27℃培养箱培养24h）。后采用CCK-8检测细胞存活率法测细胞活性后以DnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡情况,通过Western-Blot技术,检测三组细胞标本PI3K与p-PI3k蛋白的表达,结果采用SPSS17.0分析。[结果]（1）CCK-8法测定不同时间处理的OGD/R组细胞活性:以OGD/R组第0h为对照组,3h细胞活性下降,两组间差异无统计学意义（P>0.05）;6h后较对照组明显下降,两组间差异有统计学意义（P<0.05）;随着OGD/R时间延长,12h与24h的细胞活性降低,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）CCK-8法测定不同温度下PC12细胞活性:以37℃对照组细胞活力为100%,对OGD/R组与LY294002组内比较,37℃与32℃LY294002组与OGD/R组细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）;以27℃对照组活性为100%,对OGD/R组与LY294002组进行组内比较,LY294002组细胞活性下降,差异有统计学意义（P<0.05）。对37℃常温组、32℃亚低温组、27℃深低温组细胞活性进行组间比较,以37℃常温组为对照,32℃亚低温组、27℃深低温组细胞活性均上升,差异有统计学意义（P<0.05）（3）以PCR扩增法以IRAK1与TNF-α炎症因子为指标验证OGD/R组细胞缺血缺氧损伤,IRAK1:以0h培养为对照,对细胞OGD/R处理6h后,IRAK1的表达随时间延长而升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;随着OGD/R时间延长,12h与24h的IRAK1的mRNA表达继续升高,差异有统计学意义（P<0.05）。TNF-α:以0h培养为对照,对细胞OGD/R处理6h后,TNF-α的mRNA表达水平随时间延长而升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,随着OGD/R时间延长,12h与24h的TNF-α的表达,随时间延长而升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）DnnexinV/PI双染法细胞凋亡分析:在37℃常温组、32℃亚低温组、27℃深低温三个温度下,将OGD/R组与LY294002组进行比较,LY294002组的凋亡率均显著上升,差异均有统计学意义（P<0.05）。对37℃常温组、32℃亚低温组、27℃深低温组细胞凋亡进行组间比较,以37℃常温组为对照组,32℃亚低温组、27℃深低温组细胞凋亡均下降,差异有统计学意义（P<0.05）（5）Western-Blot测p-PI3K/PI3K蛋白的表达:对OGD/R组与LY294002组p-PI3K/PI3K 比值进行比较,以OGD/R组为对照,LY294002组p-PI3K/PI3K显著下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;对37℃常温组、32℃亚低温组、27℃深低温组三组细胞p-PI3K/PI3K表达进行组内比较对比,以37℃常温组为对照,32℃亚低温组、27℃深低温组细胞p-PI3K/PI3K 比值均下降,差异有统计学意义（P<0.05）。[结论]（1）在未加任何干预条件,37℃、32℃、27℃三种温度培养的PC12细胞,37℃组细胞活力最高。（2）经过OGD/R处理,37℃、32℃、27℃三种温度培养的PC12细胞,27℃组细胞活力最高。（3）PC12细胞经OGD/R处理6h,IRAKI、TNF-α炎性因子表达量显著增高,可模仿缺血性脑卒中模型。（4）加入抑制剂LY294002,PI3K蛋白表达降低,细胞凋亡率增高。（5）本实验37℃、32℃、27℃三种温度中,27℃细胞组磷酸化的PI3K信号表达最高,细胞凋亡率最低。
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