【摘 要】
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本研究选取了目前关注较多的高温放线菌为研究材料。Thermobifida halotolerans YIM 90462T是云南大学省微生物研究所放线菌研究室2008年在云南省黑井盐矿分离并经多相分类研究确定的高温双歧菌属的一个新种。而高温双歧菌属一般都具有分泌木聚糖酶的能力,目前研究较透彻的是Thermobifida fuscaYX分泌的木聚糖酶,其中涉及到通过对其基因改造进而提高酶学活力方面的内
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本研究选取了目前关注较多的高温放线菌为研究材料。Thermobifida halotolerans YIM 90462T是云南大学省微生物研究所放线菌研究室2008年在云南省黑井盐矿分离并经多相分类研究确定的高温双歧菌属的一个新种。而高温双歧菌属一般都具有分泌木聚糖酶的能力,目前研究较透彻的是Thermobifida fuscaYX分泌的木聚糖酶,其中涉及到通过对其基因改造进而提高酶学活力方面的内容。2009年云南大学胡松楠曾通过蛋白酶的纯化工艺从T. halotolerans发酵液中分离到具有嗜高温,耐碱性等特殊的酶学性质的木聚糖酶Xyn I。本研究希望利用分子遗传学操作手段对其木聚糖酶基因进行克隆、表达并获取相关基因序列,同时研究其酶学性质,探讨其工业应用潜力。研究的实验结果如下：1.对高G+C含量T. halotolerans YIM 90462T木聚糖酶基因扩增的方法进行了探索研究,寻找最佳的实验方案。运用在线软件CODEHOP设计相应的简并引物扩增到了T. halotolerans YIM 90462T木聚糖酶基因的保守区域。先后用5种不同的PCR技术对已知保守区域的侧链基因序列扩增,并对其的实验原理、优点、缺陷进行了比较说明。以及为其它高G+C含量的放线菌功能基因的扩增提供一个可参考的实验方案的。2.扩增到了T. halotolerans YIM 90462T属于第11家族的木聚糖酶完整基因序列,命名为：Xyn11-1. Xyn11-1基因有1008个碱基对,编码335个氨基酸残基。理论分子量大约为35 kDa,理论等电点9.34。根据氨基酸序列的三级结构的同源模建,保守区分析,序列比对以及系统进化分析表明,Xynll-1是属于第11家族的嗜高温木聚糖酶。3.成功完成了原核表达载体（Xyn11-1-pET28a/BL21）的构建工作,以及酶的诱导表达及纯化。对重组Xyn11-1木聚糖酶的酶学特性研究表明,其最适反应温度为70℃,最适反应pH为9.0。部分金属离子对重组Xynl 1-1木聚糖酶酶活具有激活或抑制作用,且活性部位可能含有丝氨酸及二硫键。研究的亮点：1.获得了嗜热耐盐放线菌新菌种T. halotolerans一个第11家族的木聚糖酶基因；2.采用了基于染色体基因定位的染色体步行的PCR技术体系。
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