哺乳动物卵子质量是决定动物繁殖力的先决条件之一,卵子质量低下会导致卵子成熟障碍、受精失败以及胚胎发育异常,严重制约动物繁殖性能和畜牧业的发展。影响卵子质量的主要因素包括遗传和环境两大方面,均涉及到卵子成熟过程中的各种关键生物学事件,例如细胞骨架组装、染色体分离、线粒体动态以及皮质颗粒分布等。越来越多研究显示,相对于遗传因素,环境因素对于卵子质量和动物繁殖力的影响更为广泛,各种大气、水、土壤污染物、饲料成分、饲养管理水平等外部环境因素都在一定程度上干扰了家畜的生长和繁殖性能。目前虽然已有部分环境因素被研究报道损害了卵子质量,但更多其它因素尚未明确。因此,探索这些环境中潜在的危害物质是否影响卵子质量及其作用机制,将有助于我们进一步认识和理解环境因素阻碍卵子成熟与受精过程的生物学特征,为优化动物卵子质量和增强繁殖性能提供新思路。AAI是一种来源于马兜铃属和细辛属各种草本植物化合物,普遍用于中草药中。随后发现,AAI具有肾毒性和致癌性,可导致肾脏衰竭和肝癌的发生。此外,AAI也是一种土壤污染物,能够在土壤中被吸收并以时间和剂量依赖的方式在粮食作物中富集,从而进入人类和动物的食物链引起疾病的发生。目前已有研究报道,AAI还是一种危害较大的卵巢毒性物质,可明显减少卵巢的储备和排卵的数量,但是AAI对卵母细胞是否产生影响尚不清楚。本研究将猪卵母细胞作为研究对象,通过体外成熟、体外受精、早期胚胎培养体系,和免疫荧光染色、蛋白免疫印迹等技术,研究了马兜铃酸Ⅰ（Aristolochic acid I,AAI）对猪卵母细胞体外成熟和受精的影响,揭示了其潜在的作用机制。本研究主要分为三个部分,具体实验内容和研究结果如下:实验一 AAI扰乱猪卵母细胞核成熟过程通过在体外培养中添加不同浓度的AAI,观察AAI对猪卵母细胞减数分裂进程和受精能力的影响。结果显示100μM浓度的AAI可显著抑制猪卵母细胞的卵丘扩散和降低极体率,表明AAI阻碍了卵母细胞体外成熟。由于卵母细胞成熟过程分为核成熟与胞质成熟,且染色体上载有大量遗传信息,对细胞发育具有重要调控作用,我们进一步对纺锤体组装和染色体排列进行检测来探究AAI是否对核成熟产生影响。结果表明AAI处理后纺锤体组装出现错误,呈现多极或扭曲等异常形态,染色体分布凌乱没有整齐地排列在赤道板上。而纺锤体组装异常通常与微管动态相关,因此我们继续对微管蛋白的稳定性进行了探究。免疫荧光结果显示AAI处理明显降低了微管蛋白的乙酰化水平,此观察也得到了免疫印迹实验的验证。综上所述,实验数据表明AAI处理破坏了猪卵母细胞减数分裂核成熟的过程。实验二AAI损害猪卵母细胞胞质成熟过程卵母细胞成熟过程中核成熟与胞质成熟并不同步,核成熟完成不能确保胞质成熟的正常进行,因此我们也进一步对胞质内相关细胞骨架和细胞器进行了检测,探究AAI是否对猪卵母细胞胞质成熟也产生影响。微丝是重要的细胞骨架成分之一,在卵母细胞中对纺锤体的定位、迁移和细胞极性的确立都至关重要。免疫荧光成像和定量分析结果显示AAI处理显著降低了微丝在细胞膜上的分布和聚集。线粒体和皮质颗粒的正常动态分布是卵母细胞胞质成熟的重要指标。经检测后发现,AAI处理导致线粒体异常分布率大幅增加且荧光强度明显下降,提示线粒体的完整性被破坏。此外,皮质颗粒的迁移也受到损害,没有正确地分布在卵母细胞皮质区,呈现缺失的状态。Ovastacin是皮质颗粒中的核心成分,主要负责切割透明带上精子结合位点防止多精受精的发生,若其定位发生错误则会导致受精失败。免疫荧光数据显示,ovastacin在皮质区的分布出现异常且荧光强度明显降低,这可能是由于皮质颗粒受损引起ovastacin的提前释放而造成的,暗示了卵母细胞结合精子的能力下降。综上所述,AAI通过影响微丝的组装,损害线粒体、皮质颗粒的分布和完整性以及破坏皮质颗粒成分ovastacin的正确定位来干扰猪卵母细胞胞质成熟的过程。实验三AAI通过诱导氧化应激造成DNA损伤和细胞凋亡影响猪卵母细胞体外成熟和受精Ovastacin的定位异常预示AAI处理可能对猪卵母细胞的受精过程产生影响,为此我们通过精卵结合实验和体外受精实验对卵母细胞的受精潜力进行测试。实验结果显示AAI处理后卵母细胞透明带上精子结合的数量显著减少,并且受精发育到2细胞胚胎的比率也明显降低。这与ovastacin的提前释放导致精子结合位点缺失,造成精卵结合缺陷进而影响受精的观察是一致的。作为一种细胞毒性物质,AAI在体细胞中可引起氧化应激造成DNA损伤,破坏细胞正常的生理活动,加快细胞凋亡。为了探究在卵母细胞内是否也如此,我们对活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,DNA损伤程度和细胞凋亡率进行了评估。结果表明,AAI处理后的猪卵母细胞内ROS的水平明显升高,DNA损伤积累增多以及细胞早期凋亡的比率显著上升。综上所述,所有实验结果证明AAI可诱导过多的ROS积累,造成氧化性DNA损伤,加快卵母细胞早期凋亡,进而对卵母细胞体外成熟和受精产生负面影响。