背景：恶性黑色素瘤(Malignant Melanoma, MM),是起源于神经脊黑色素细胞的恶性肿瘤。近几十年来,恶性黑色素瘤在全球的发病率迅猛升高,成为所有恶性肿瘤中发病率增长最快的肿瘤,年增长率几乎达到3-5%。其中白色人种发病率明显高于其他人种,澳大利亚昆士兰地区和美国的南亚利桑那州为恶性黑色素瘤的高发地区,我国和日本等亚洲国家的黑色素瘤发病率与欧美国家相比相对较低,但近年来其发病率呈迅猛上升趋势。恶性黑色素瘤是世界上恶性程度较高的肿瘤之一,该病起病隐匿,易发生转移,当前已成为发达国家皮肤癌死亡率最高的肿瘤。它的预后因素与年龄、性别、部位、肿瘤的浸润深度、淋巴结转移情况、是否溃疡及手术方式等相关。对于早期的局限性病变,外科手术切除是黑色素瘤的最佳治疗原则,然而术后发生转移的几率大。对于晚期转移性恶性黑色素瘤患者,绝大多数需接受全身性系统治疗,但是黑色素瘤细胞对传统的放、化疗均不敏感,所以寻求治疗恶性黑色素瘤的治疗靶点迫在眉睫。Notch信号通路不仅对正常细胞的分化起作用,而且与肿瘤的发生发展也密切相连,影响肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等。在哺乳动物中,Notch是由4个受体(Notchl-4)及5个配体(Delta-likel,3-4, and Jaggedl-2)组成。这条通路激活是通过Notch受体与相邻细胞表面的配体结合,引起Notch受体细胞外结构的改变,导致γ-分泌酶复合体切割并释放Notch受体胞内区NICD(Notchintracellular domain)进入细胞核,NICD通过其RAM(RBP Jk associated molecular)结构域与CSL(CBF-1/suppressor of hairless/Lag-1)蛋白结合导致共抑制复合物解离,并募集共活化分子MAML1(mastermind-like1)组成共三聚体,从而启动下游基因的转录。在Notch的4个受体当中,Notch1是在肿瘤组织中最常被检测到的家族成员,对肿瘤的发生发展以及演进的过程起到了关键性作用。值得注意的是,Notch信号通路在肿瘤形成过程中既可以充当促癌基因角色又可以充当抑癌基因角色,主要取决于不同肿瘤以及其不同的发展阶段。近年来对恶性黑色素瘤的研究发现,Notch1呈高表达状态并主要起着促癌作用,Notch1蛋白的高表达和天然活化阻止黑色素细胞正常分化,从而导致黑色素肿瘤的发生,间接参与了黑色素细胞的早期恶变。siRNA干扰技术是近年来基因表达调控的研究热点之一,它是由小分子干扰RNA引发诱导的转录后的基因沉默过程。与传统的肿瘤抑制治疗技术相比,siRNA不仅简单有效,而且能特异地下调细胞中基因的表达。目前,siRNA靶向抑制Notch1基因进而抑制肿瘤细胞生长与增殖的相关现象已在胶质瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、急性T淋巴细胞白血病等肿瘤疾病的研究中得到了证实。但在恶性黑色素瘤中,靶向Notch1基因的siRNA是否也可以下调Notch及其下游信号传导通路来发挥其生物学作用,还需要我们进一步证实。因此,本研究拟用RNA干扰技术来探讨Notch1在恶性黑色素瘤发生发展中的作用。以小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞为研究对象,应用siRNA技术下调Notch1的表达,体外观察其对黑色素瘤细胞增殖的影响；同时,拟将转染后细胞注射至同基因来源的C57BL/6小鼠皮下,观察肿瘤的生长速度及Notch1、增殖活跃性指标细胞核相关抗原Ki-67、增殖细胞核抗原PCNA的表达变化,从而明确Notch1在体内对黑色素瘤增殖的影响。目的：1.探讨通过siRNA技术沉默Notch1进而抑制小鼠恶性黑色素瘤生长与细胞增殖的可行性。2.探讨Notch1是否能作为治疗恶性黑色素瘤的靶点,进而为寻求治疗恶性黑色瘤的新方法提供理论依据。材料与方法：1.主要的实验材料1.1细胞及实验动物来源小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16F1由美国芝加哥大学孟玉茹教授赠与；C57BL/6雌性小鼠,6-8周龄,体质量18-22g,购自南方医科大学实验动物中心,于南方医科大学南方医院实验动物研究中心SPF级环境中饲养。1.2实验试剂胎牛血清、高糖DLipofectamineTM2000、Notchl siRNA Oligo及阴性对照、Trizol、PrimeScript(?) RT reagent试剂盒、SYBR(?) Premix Ex TaqTM试剂盒、Notchl引物、山羊抗小鼠的Notchl多克隆抗体、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、PVDF膜、MTT试剂盒、DMSO、结晶紫染料、兔抗小鼠的Ki-67单克隆抗体、兔抗小鼠的PCNA多克隆抗体、辣根过氧化酶(HRP)标记山羊二抗试剂盒、HRP标记兔二抗试剂盒、DAB显色剂、AEC显色剂、苏木素、伊红、无水乙醇、95%酒精、1%盐酸酒精等。1.3实验仪器二氧化碳恒温培养箱、超净工作台、恒温循环水浴锅、光学显微镜、荧光显微镜、高速冷冻离心机、台式离心机、电泳系统、酶标仪、PCR仪、荧光定量PCR反应仪、分光光度计、石蜡切片机、石蜡包埋机、-80℃冰箱、通风柜、微波炉、电子秤、游标卡尺、眼科剪、眼科镊、lml注射器、培养皿、吸管、微量移液器、试管、EP管、冻存管、载玻片、盖玻片等。2.细胞培养B16F1细胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,每2-3天行传代培养。3.实验流程3.1靶向Notchl基因的siRNA转染小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞株利用siDESIEN网站设计靶向Notchl基因的siRNA,委托由上海吉玛生物公司合成。前期从预先设计的6对序列中选出1对作为目的siRNA,采用Invitrogen公司的lipofectamineTM2000介导的脂质体转染技术转染细胞。转染了靶向Notch1基因siRNA的B16F1细胞用siNotch1表示、转染空载体siRNA阴性对照(negative control)的B16F1细胞用siNC表示、只加转染试剂lipofectamineTM2000对照的未处理B16F1细胞用mock表示。转染后采用RT-PCR以及Western blot验证沉默效率。3.2siNotch1对B16F1细胞体外生长特性的比较分析经上述siRNA技术瞬时转染的小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞株,行MTT比色法检测细胞增殖能力以及细胞克隆试验观察三组细胞克隆形成能力,克隆形成率的计算方式为形成克隆的数目／接种细胞的数目×100%,体外初步评价Notch1对恶性黑色素瘤细胞生物学功能的影响。3.3siNotch1对B16F1细胞体内生长特性的比较分析分别用转染后的三组细胞建立C57BL/6小鼠恶性黑色素瘤模型,动物皮下成瘤后每3-4天进行一次相应siRNA的瘤内注射,以保证稳定的转染效果,接种后的第31天断颈处死小鼠,取肿瘤标本比较各组肿瘤体积并行HE染色观察组织病理改变以及免疫组化检测肿瘤组织Notch1蛋白、细胞核相关抗原Ki-67及增殖细胞核抗原PCNA的表达情况。免疫组化染色结果采用双盲法判定,每张切片随机选择5个高倍视野(x400),每个视野计数100个细胞,计算阳性细胞占肿瘤细胞的占百分比。4.数据分析采用SPSS13.0统计软件行统计学处理。实验数据采用均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析RT-PCR、Western blot、细胞克隆及免疫组化实验的统计学差异,采用析因方差分析MTT细胞增殖的检测以及肿瘤体积观察。所有检验均为双侧检验,当P<0.05时差异具有统计学意义。结果：1.siNotchl成功转染小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞株结果表明,通过RT-PCR和Western blot检测,siNotchl转染B16F1细胞后的Notchl表达水平较空载体siNC组和未处理mock组显著降低(P<0.05),而siNC和mock组细胞间的Notchl表达水平无差异(P>0.05)。2. siNotchl体外抑制小鼠恶性黑色素瘤细胞的增殖以及克隆形成MTT实验结果表明,从转染后的第2天开始,siNotchl沉默组的增殖速度显著慢于siNC空载体组和未处理mock组(P<0.05)。同样,细胞克隆形成实验结果显示siNotchl组、siNC组以及mock组细胞的克隆形成率分别为(0.157±0.021)%、(0.760±0.030)%、(0.787±0.031)%, siNotch1沉默组显著低于siNC和mock组(P<0.05),而空载体siNC组和未处理mock组细胞间克隆形成率无差异(P>0.05)。3. siNotchl体内抑制小鼠恶性黑色素瘤的成瘤能力结果发现,第31天处死小鼠,测量肿瘤体积,三组的肿瘤平均体积分别为1307.947±161.914mm3,2970.683±140.945mm3和3078.987±252.257mm3,siNotchl组的肿瘤体积显著小于siNC和mock组,有统计学差异(P<0.05),而siNC和mock组之间的瘤体积则无显著差异(P>0.05)。HE染色发现siNotchl沉默组肿瘤组织镜下见多处大片坏死灶,肿瘤细胞异型性不明显,siNC空载体组及mock未处理组肿瘤细胞异型性明显,组织中含丰富的新生血管,坏死灶较少。免疫组化结果显示siNotchl沉默组、siNC空载体组及mock未处理组Notchl蛋白的阳性细胞百率分别为(41.44±6.84)%、(87.20±4.53)%、(90.36±5.25)%,siNotchl组明显低于另两组(P<0.05)。同样,增殖指标Ki-67和PCNA的表达在siNotchl组的表达也显著低于其他两对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：1.在小鼠恶性黑色素瘤中,通过siRNA技术沉默Notchl是可行的,并且在体内外抑制了小鼠恶性黑色素瘤B16F1细胞的增殖与肿瘤的生长。2. Notchl基因在小鼠恶性黑色素瘤细胞的增殖中起至关重要的作用,可望成为治疗恶性黑色素瘤的有效靶点,而siNotchl可能是治疗恶性黑色素瘤的有效途径。