目的:本研究以我国11种常见食源性致病菌包括副溶血性弧菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌、福式志贺菌、A型肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌以及蜡样芽胞杆菌的特异性基因作为检测靶标,通过公共引物为媒介,旨在研发一种高通量的多重PCR检测体系(Common primer-multiplex polymerase chain reaction,CP-MPCR),建立可在一个反应管内检测多种常见食源性致病菌的核酸检测方法。方法:(1)设计和筛选公共引物:按照公共引物设计原则,利用Primer 5.0软件设计和NCBI数据库中BLAST在线比对工具初步理论筛选与所有细菌基因组DNA均无同源性的公共引物,随后以1 1种食源性致病菌基因组DNA为模板通过温度梯度PCR实验进一步筛选出特异性好的公共引物。构建含有公共引物序列的质粒模板,检测特异性实验筛选出的各个公共引物的敏感性。(2)CP-MPCR体系的建立:通过查阅文献确定11种食源性致病菌的保守基因,设计筛选特异性引物,与理论设计和实验筛选出的公共引物连接构成嵌合引物。随后以11种致病菌基因组DNA混合物为模板通过PCR实验分别验证每一对嵌合引物特异性。建立优化CP-MPCR体系,确定最佳引物浓度、扩增体系和程序,检测CP-MPCR体系的特异性与敏感性。(3)CP-MPCR体系的实际应用:以从苏州市疾控中心收集的100株致病菌分离株进一步验证优化的CP-MPCR体系的特异性。从苏州市疾控中心收集到60份肛拭子样本以及从苏州食检所收集到16份食物样本增菌液,采用本课题构建的最终优化的CP-MPCR体系进行检测,验证CP-MPCR体系的实际应用性。结果:(1)本课题成功设计筛选出3条公共引物Ua、Ub、Uc,通过温度梯度PCR实验验证显示与11种食源性致病菌的基因组DNA均未扩增出任何条带,并且三条公共引物敏感性依次为105、103、104 copies/μL。(2)针对11种致病菌理论设计和实验筛选出特异性较好的嵌合引物并成功构建能够同时检测多种食源性致病菌的CP-MPCR体系。通过单模板、二模板、五模板和六模板实验验证CP-MPCR体系具有良好的特异性和分析多个模板的能力。采用CP-MPCR体系对细菌基因组DNA的梯度稀释液和纯菌培养液的梯度稀释液进行敏感性实验,实验结果显示CP-MPCR体系对细菌基因组DNA检测敏感性大约在0.01至0.1 ng/μL之间,菌液敏感性在103至104 CFU/mL,其敏感性足以应用到实际检测当中。(3)100株致病菌分离株验证了本课题构建的最终优化的CP-MPCR体系具有很好的特异性,目的菌株均产生了目的条带,非目的菌株无任何条带产生;60份肛拭子样本与16份食物样本增菌液中被CP-MPCR体系检出的阳性样本同时采用专利引物或中华人民共和国出入境检验检疫行业标准引物进行验证,且阳性样本的PCR扩增产物通过测序验证,结果均证实与本研究构建的CP-MPCR体系检测结果一致。结论:本课题构建的CP-MPCR体系具有较好的敏感性和特异性,能够实现对我国常见11种食源性致病菌的非定向筛查,有利于控制预防食源性致病菌的传播以及预防食源性疾病的发生,具有一定的实际应用价值。