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双果糖酐Ⅲ(difructo se anhydride,DFA Ⅲ)是近年来发现的一种新型天然功能性甜味剂,具有促进矿物质吸收、促进骨骼生长、改善便秘等功能,而且甜度较高但能量较低,并具有良好的理化性质,适用于烘焙、饮料、医药制剂中。但是DFA Ⅲ在自然界中含量较低,利用提取分离的手段获得产品的成本较高;而通过利用化学法制备DFA Ⅲ也存在产物中同分异构体较多,分离纯化困难,并且污染环境等问题。因此,该产品目前主要是采用生物法制备:利用菊糖果糖基转移酶(IFTase)催化菊糖分解生成DFA Ⅲ。该方法转化率高,安全可靠,并且菊糖来源广泛,适用于大规模工业化生产,是近年来研究的热点。但是现有的IFTase普遍存在酶活性不高,转化率低,生产成本高等问题,因此利用现代分子生物学手段获得新的IFTase,提高催化效率,降低转化成本对于推动DFA Ⅲ的广泛应用十分重要。本研究首先通过生物信息分析,对IFTase的氨基酸序列进行对比,通过分子克隆和表达,获得来源于克雷伯氏菌的目的基因编码的酶Kp-IFTase。经初步鉴定,该酶具有催化菊糖分解生成双果糖苷Ⅲ及其它果寡糖的功能。该酶具有良好的耐热性并且pH稳定性质非常优异,在pH 3.0-10.0之间均能保持80%以上的剩余酶活,对于极酸碱条件具有很强的耐受性;该酶的储藏稳定性好,在4℃储藏35天后仍能保持50%以上的剩余酶活;该酶还具有较强的有机溶剂、金属离子及蛋白变性剂等化学物质的耐受性。这些性质决定了该酶在工业生产方面具有重要的应用前景。同时,我们还实现了对一段来源于金黄节杆菌编码Aa-IFTase基因的克隆和表达。为了克服目前载体在用于Aa-IFTase基因及其它一些基因克隆时,存在效率低,多克隆位点选择不便,表达水平低等问题,因此,我们构建了一种新型的质粒载体pANY1,并已经提交Addgene库(Addgene No.110949)。pANY1载体设计了两个多克隆位点区,能够同时满足粘性末端克隆,平末端克隆,基于重组酶克隆,以及利用Ahd I酶切的方式制备T载体进行TA克隆等多种克隆策略的要求。而且,该质粒载体上带有ccdB基因序列,编码的毒蛋白使得该载体能够实现零背景克隆,解决了假阳性克隆的问题。另外,该质粒载体含有T7启动子、终止子和组氨酸标签等结构,可以实现对目的基因的高效表达以及对表达的蛋白进行纯化的功能。基于pANY1载体,该研究还设计了一种新型的APP克隆策略,进一步克服了传统分子克隆过程中粘性末端选择方面的限制。同时,pANY1载体的建立,也为其它分子克隆和蛋白表达研究提供了新的高效的选择。在此基础上,成功实现了Aa-IFTase的无背景克隆和高效表达,并为下一步基因库的构建奠定了基础。为了进一步提高IFTase的活性和DFA Ⅲ的产率,本研究设计了一种基于宏基因区段改组的方式,对构建的Aa-IFTase进行了分子改造。首先采用CodeHope方法,基于IFTase的同源区段设计简并引物,以提取到的五种土壤样品中的宏基因组DNA为模板,通过PCR从宏基因组中获取IFTase的同源区段,接下来利用同源重组的方式,替代Aa-IFTase的相应区段,并进行活性筛选,建立起了IFTase筛选平台。为了获得高质量的宏基因组DNA样品,保证DNA的丰富度和代表性,在研究过程中,本实验建立了一种新的宏基因组DNA提取方法,并采用本方法从多种土壤样品中提取了宏基因组DNA。通过对提取的DNA样品进行16s rDNA高通量测序分析,发现该方法与天根生物公司设计的商品宏基因组DNA提取试剂盒提取的宏基因组DNA样品相比,在提取革兰氏阳性菌的基因组DNA方面更加有效。为了进一步提高酶的催化效率,降低产DFA Ⅲ的成本,本研究结合交联酶聚集体(CLEAs)和仿生硅技术,并且创新性的使用了凝结多糖作为成孔剂,制备了基于凝结多糖的球形介孔二氧化硅微粒(curdlan-based mesoporous silica microspheres(CMSiM)),实现了对Aa-IFTase的包埋(即CMSiM-Aa-IFTase)。与传统的交联酶聚集体相比,将Aa-IFTase包埋于CMSiM中可显著提高酶的催化效率。并且,用仿生硅包埋后,在其表面添加一层硅壳,可以显著提高酶的机械稳定性;而微球上的介孔结构可进一步提高酶与底物的接触面积。通过测定不同浓度的凝结多糖、不同饱和度的硫酸铵、不同浓度的戊二醛、不同交联时间等因素,对包埋条件进行了优化。研究结果表明:CMSiM-Aa-IFTase的最适温度较游离酶提高了10℃,在更加广泛的温度和pH下保持较高的酶活。并且比游离酶在储存稳定性等方面表现出显著的优越性。最有价值的一点是CMSiM-Aa-IFTase在经历10次重复利用后仍能保持75%以上的初始酶活,显示出非常好的重复利用的能力。还有一点值得注意的是,在经历斡旋震荡后,酶活有了不同程度的提升,而游离酶的酶活显示降低。这些研究结果对于制备多种用于改善酶性质的多孔材料方面的相关研究有重要的借鉴价值。而且本实验对IFTase进行包埋研究的尝试,为今后更有效的进行DFA Ⅲ的生产奠定基础。