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长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)是一类转录本长度超过200 nt,不具有编码潜能的RNA,其在表观遗传调控、转录调控及转录后调控等多种层面调控基因的表达。已有研究证明lnc RNA参与了植物诸多生长发育过程。在前期研究中,本实验室以一对隐性基因控制的白菜(Brassica campestris ssp.chinensis,syn.B.rapa ssp.chinensis)核不育两用系‘Bcajh97-01A/B’的五级花蕾为材料进行转录组测序(RNA-seq),鉴定出一条在不育株系中特异表达的lnc RNA——BrLMaP(lnc RNA of BrMYB80a promoter)。该lnc RNA位于转录因子MYB80编码基因Bra002847(命名为BrMYB80a)的启动子区域,而MYB80是拟南芥花粉外壁发育的关键调控因子,其表达缺失能引起花粉彻底败育。在白菜基因组中,除Bra002847外,还存在MYB80另一个拷贝,即Bra035604(命名为BrMYB80b),BrMYB80a与BrMYB80b分别位于白菜基因组的第10号和第2号染色体上,但在BrMYB80b的启动子区域未发现类似于BrLMaP的lnc RNA。我们推测BrLMaP可能通过调节BrMYB80a和(或)BrMYB80b的表达而作用于花粉发育过程。本论文在利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得BrLMaP的全长序列的基础上,对其在不同组织及花粉发育不同时期的花蕾中的表达进行了分析,最后通过在‘油青四九’菜心中进行BrLMaP过表达和RNAi沉默载体的遗传转化,探究了其在花粉发育过程中的生物学功能,并对其是否参与BrMYB80a和(或)BrMYB80b的表达调控进行了分析。取得以下主要结果:(1)以RNA-seq得到的BrLMaP的部分序列设计引物,通过RACE技术获得BrLMaP转录本全长,并以此设计引物克隆获得该lnc RNA的DNA序列。BrLMaP具有3个内含子,其转录本全长557 nt,对转录本进行编码潜能分析,发现其编码潜能极低,且其开放阅读框(ORF)的长度小于200 nt,明确BrLMaP是正义长链非编码RNA。(2)通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验,验证了RNA-seq结果中发现的BrLMaP在白菜‘Bcajh97-01A/B’的不育株系花蕾中特异表达的特点。同时也验证了MYB80在白菜中的两个拷贝BrMYB80a和BrMYB80b在‘Bcajh97-01A/B’中的差异表达特征。在根、茎、叶片、花序和荚果中的表达检测结果显示,BrLMaP与BrMYB80a和BrMYB80b仅在花序中特异表达;在不育株系‘Bcajh97-01A’中,BrLMaP与BrMYB80a和BrMYB80b在花蕾发育的A3时期即单核小孢子时期特异高表达;而在可育株系‘Bcajh97-01B’中,BrMYB80a和BrMYB80b在花蕾发育的B2时期即四分体时期出现高表达,也就是说BrMYB80a和BrMYB80b在‘Bcajh97-01A’中的表达相较于‘Bcajh97-01B’中延迟。(3)构建BrLMaP过量表达载体,转化‘油青四九’菜心,对获得的转基因植株进行细胞学和形态学观察,发现过表达菜心植株出现四个萌发沟的大花粉,且在双核小孢子时期便能观察到花粉细胞质逐渐开始降解的现象,花粉体外实验显示约32%的花粉不能萌发,而35%的花粉虽然能萌发但花粉管不能伸长,发生顶端爆裂。在BrLMaP过量表达的转基因菜心花序中检测到BrMYB80a和BrMYB80b的表达量均有不同程度的下调,据此推测BrLMaP可能通过调控BrMYB80a和BrMYB80b的表达来参与花粉发育。(4)构建BrLMaP的RNAi载体,转化‘油青四九’菜心,通过亚历山大染色发现花粉活力正常,扫描电镜观察花粉表面结构发现其外壁的网纹结构比对照密集。在BrLMaP表达抑制的转基因株系中检测到BrMYB80b的表达量升高,这说明BrMYB80b的上调表达可能会使花粉外壁的孢粉素过度堆积。(5)综合分析BrLMaP过量表达及表达抑制转基因植株中BrMYB80a和BrMYB80b的表达变化,BrMYB80b的表达与BrLMaP呈负相关,推测BrLMaP可能通过反式作用调控BrMYB80b的表达。而BrMYB80a的表达在BrLMaP过量表达的转基因植株中也与BrLMaP呈负相关,但在BrLMaP表达抑制转基因植株中表达量无显著性变化,其中的规律和原因还需进一步研究。