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目的:蛴螬是鞘翅目金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates及同属近缘昆虫的干燥幼虫,作为药用,始记载于《神农本草经》。前期对蛴螬多糖的活性初筛时发现蛴螬多糖组分HDPS-2Ⅱ有抑制肿瘤生长的作用,但其抗肿瘤血管生成的药理活性及其作用机制尚不明确。因此,本研究旨在进一步全面评价HDPS-2Ⅱ抗肿瘤血管生成的药理活性,并初步探究其抗肿瘤血管生成的分子机制,为中药抗肿瘤新药的研发奠定基础。方法:1.用人肝癌SMMC-7721细胞条件培养液(SMMC-7721CM)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生成的肿瘤源性内皮细胞(H-TDEC)作为体外模型,分别采用MTT、划痕和Transwell实验考察HDPS-2Ⅱ体外对H-TDEC增殖、迁移和侵袭的抑制作用。裸鼠人肝癌异种移植瘤模型考察HDPS-2Ⅱ的体内抗病理性肿瘤血管生成活性;H&E染色观察小鼠肿瘤组织形态;免疫组化法测定移植瘤微血管密度。2. 以HUVEC为体外模型,分别采用MTT、划痕和Transwell实验考察HDPS-2 Ⅱ体外对HUVEC增殖和迁移的抑制作用。血管荧光斑马鱼模型考察HDPS-2Ⅱ的体内抗生理性血管生成活性。3. 微量热泳动技术(MST)测定HDPS-2Ⅱ与Gal-1和Gal-3的直接相互作用。Western blot法测定HDPS-2Ⅱ对HUVEC和H-TDEC中Gal-1、Vimentin和VE-cadherin蛋白表达的影响。4. 以小鼠脑微血管内皮细胞(b End.3)为工具细胞,分别用MTT、划痕、Transwell和微管形成实验考察HDPS-2Ⅱ体外抗b End.3细胞增殖、迁移和微管形成活性,同时Western blot法测定HDPS-2Ⅱ对b End.3和经SMMC-7721CM诱导的b-TDEC细胞中Gal-1、Vimentin和VE-cadherin蛋白表达的影响,以评价b End.3替代HUVEC来构建Gal-1过表达内皮细胞用于后续信号通路研究的可行性。5.慢病毒转染b End.3构建Gal-1过表达内皮细胞株OE-Gal-1(OE-NEG-CON为阴性对照)。Western blot测定HDPS-2Ⅱ对稳转细胞株中Gal-1、p-VEGFR2、VEGFR2、Vimentin和VE-cadherin蛋白表达的影响。结果:1.与HUVEC相比,0.03～300 mg/L HDPS-2Ⅱ分别处理24、48和72h对H-TDEC的增殖有更强的抑制作用;10 mg/L和30 mg/L HDPS-2Ⅱ对H-TDEC的迁移和侵袭有显著抑制作用。在裸鼠体内,HDPS-2Ⅱ可剂量依赖性的抑制肝癌移植瘤的生长,其中40 mg/kg HDPS-2Ⅱ的抑瘤率为65.6%(sorafenib组为93.5%);40 mg/kg HDPS-2Ⅱ组肿瘤组织出现大面积的坏死,体内肿瘤微血管形成的抑制率为74.4%(sorafenib组为87.2%)。2.与空白对照组相比,0.03～300 mg/L HDPS-2Ⅱ分别处理24、48和72 h对HUVEC的增殖均无明显抑制作用;30 mg/L HDPS-2Ⅱ对HUVEC的迁移有一定的抑制作用。不同剂量的HDPS-2Ⅱ对斑马鱼体内节间生理性血管生成均无明显的抑制作用。3.MST结果显示,HDPS-2Ⅱ与Gal-1之间(亲和力常数K_d=17.2±7.3μM)有很强的亲和性,而与Gal-3的亲和性较弱(K_d=527.18±0.3μM)。Western blot结果显示,与HUVEC相比,经SMMC-7721CM诱导后生成的H-TDEC中Gal-1和Vimentin表达上调,VE-cadherin表达下调;给药处理24 h后,HDPS-2Ⅱ可浓度依赖性地下调Gal-1和Vimentin的同时上调VE-cadherin的表达量,其中,相同浓度的HDPS-2Ⅱ对H-TDEC细胞中Gal-1、Vimentin和VE-cadherin的表达影响更显著。4. HDPS-2Ⅱ对b End.3和b-TDEC(b End.3经SMMC-7721CM诱导而成)细胞的增殖、迁移、微管形成及相关蛋白(Gal-1、Vimentin和VE-cadherin)表达的影响与其对HUVEC和H-TDEC的作用相似,b End.3可替代HUVEC构建Gal-1过表达内皮细胞用于后续信号通路研究。5. Western blot结果显示,与OE-NEG-CON组相比,OE-Gal-1组细胞中Gal-1的表达量明显升高,表明成功构建并筛选出过表达Gal-1内皮细胞株。给药处理24 h后,HDPS-2Ⅱ可浓度依赖性地下调Gal-1、p-VEGFR2、Vimentin的表达和上调VEGFR2、VE-cadherin的表达,其中相同浓度的HDPS-2Ⅱ对OE-Gal-1-TDEC(OE-Gal-1经SMMC-7721CM诱导而成)细胞中Gal-1、p-VEGFR2、VEGFR2、Vimentin和VE-cadherin的表达影响更显著。结论:1.HDPS-2Ⅱ在体外有抑制TDEC迁移、侵袭和微管形成的作用,体内有抑制肿瘤生长和肿瘤微血管生成的作用,是一种对生理性血管生成毒副作用低但对肿瘤血管生成有明显抑制作用的中药活性多糖。2.HDPS-2Ⅱ可能通过抑制Gal-1-VEGFR2信号通路来抑制TDEC的迁移、侵袭和微管形成,从而产生肿瘤血管生成的抑制作用。