论文部分内容阅读
海带配子体克隆系具有发育全能性、遗传纯合等特点,是海带种质资源保存的对象,可为海带种质改良和苗种繁育提供丰富的遗传材料。本文评价了关键环境因子对海带配子体克隆生长、发育与生殖的影响,进一步优化了调控海带配子体生长、发育与生殖的环境条件,并从外观形态、亚细胞结构、生理生化及转录组等方面,比较分析了配子体在生长、发育、生殖阶段的特征及差异。主要研究结果如下:(1)铁离子对海带配子体克隆系营养生长和生殖发育影响研究。在适宜的N、P浓度(分别为0.825 mmol/L、0.0336 mmol/L)条件下,浓度为3.60μmol/L的Fe3+对海带配子体营养生长阶段的促进作用最大;在不同N、P浓度条件下,Fe3+浓度为3.60~17.80μmol/L时能够提高海带配子体的最大荧光产量,且各浓度组之间没有显著性差异(P>0.05);N、P浓度为0.275 mmol/L、0.0112 mmol/L时,0.36~17.80μmol/L的Fe3+能够促进海带配子体由营养生长转向生殖生长,Fe3+浓度为3.60~17.80μmol/L时可显著促进海带配子体的生殖生长,且各浓度组之间没有显著性差异(P>0.05);即使N、P浓度达到0.825 mmol/L、0.0336mmol/L,在无铁条件下所有的海带配子体维持在营养生长状态;即使Fe3+浓度达到3.60μmol/L,在低N、P浓度(分别为0.007 mmol/L、0.0003 mmol/L)条件下,大部分海带配子体(65%)维持在营养生长状态,虽然小部分海带配子体(35%)进入了生殖生长状态,但生殖生长明显滞后于实验中的其他各个N、P浓度组。铁和N、P营养盐对海带配子体的营养生长和生殖生长具有协同促进作用,铁是海带配子体由营养生长到发育成熟再到有性生殖过程中的关键因素之一,缺铁会严重抑制配子体生殖发育。(2)海带配子体克隆系营养生长和生殖发育的最适光照研究。海带雌、雄配子体营养生长的最适光照条件基本相同。在本研究设定的光照条件下,光强对海带配子体营养生长的作用显著(P<0.05),随着光强的增强,营养生长的速率不断提高,在光强为80μmol photons/(m2﹒s)时,营养生长速率达到顶峰,过高光强(100μmol photons/(m2﹒s))会抑制营养生长。相同光强时蓝光下海带配子体的生长速度更快。长光照更利于营养生长,但24h连续光照相比16L:8D,对配子体营养生长的促进作用不显著。综合来看,在光强60~80μmol photons/(m2﹒s)、蓝光、16L:8D条件下,海带配子体的营养生长的速率最快,可作为配子体克隆系规模化扩繁的最佳光照条件。光强、光质和光周期都对配子体发育和生殖产生显著影响。过低或过高的光强都不利于配子体发育,光强在60μmol photons/(m2﹒s)时,配子体的发育率最高。蓝光对配子体发育的促进作用最强,白光次之,仅在红光下配子体保持营养生长,几乎不进行生殖生长。短光照(8L:16D)更利于配子体发育,长光照(16L:8D;24L:8D)下的发育率显著降低。综合来看,在光强60μmol photons/(m2﹒s)、蓝光、8L:16D条件下,海带配子体发育速度最快,发育率高,说明该光照条件是海带配子体生殖发育的最佳条件。(3)海带配子体不同生长发育阶段的细胞结构与生理生化特征研究。海带配子体从“休眠”期到破碎、转入适宜条件下生长6d,配子体处于快速营养生长阶段最佳期,配子体丝状体出现分支,细胞中开始出现蛋白核,可溶性蛋白含量最高,且线粒体的数量和体积增长,光系统Ⅱ最大荧光产量(Fv/Fm)、实际光合速率(Y(Ⅱ))、光合曲线初始斜率α和表观光合速率均最大;该阶段抗逆性较强,超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶比活力均显著较高。配子体生长到第9d,正处于由营养生长向生殖发育的过渡、开始形成卵囊阶段,该阶段处于配子囊发育初期,其抗逆性较差,尤其对光照胁迫的耐受能力较弱,Fv/Fm、Y(Ⅱ)、光合曲线初始斜率α、呼吸耗氧速率、表观光合速率以及RUBP羧化酶(Rubis CO)和丙二醛(MDH)、可溶性蛋白含量等均下降。配子体破碎后培养到12d,已经处于正常发育的状态,其抗逆性增强,配子体细胞生理代谢水平提高,为更好的发育积累营养物质。综合来看,海带配子体在生长、发育与生殖阶段表现出不同的形态结构与生理生化状态。(4)海带配子体不同生长发育阶段的转录组分析。相比“休眠”状态,处于快速营养生长的配子体,差异表达基因(DEGs)的数量是6891个,其中基因上调数为3024个,基因表达下调数为3869个;相比快速营养生长阶段,转入发育阶段时,DEGs的数量是12304个,其中7135个基因表达上调,5169个基因表达下调。对在配子体生长发育过程表达趋势显著的9710个DEGs进行GO分析,结果发现:2023个基因注释为分子功能(Molecular Function),其中1975个基因分类到催化活性(catalytic activity),有2个基因注释为GO:0004784superoxide dismutase activity,28个基因注释为GO:0004601 peroxidase activity,这些基因可能参与配子体生长发育时的活性氧调控过程。1093个基因注释到细胞组分(Cellular Component),其中1933个基因注释到细胞器(organelle),295个基因注释到GO:0005794 golgi apparatus,这些基因可能调节配子体生长发育过程中的高尔基体增多;121个基因富集到GO:0044429 mitochondrial part,这些基因可能参与配子体生长过程中的线粒体增大及呼吸作用。7323个基因注释到生物过程(Biological Process)分类中,2233个基因显著富集到生物调节(biological regulation)和生物调节过程(regulation of biological process),其中9个基因注释到GO:0015996 chlorophyll catabolic process,4个基因注释到GO:0010380 regulation of chlorophyll biosynthetic process,这部分基因可能参与了调节配子体光合作用和叶绿素含量变化。KEGG富集分析结果可知,泛素介导的蛋白水解通路上的基因在营养生长向发育过渡的过程中下调,可能参与配子体发育的调控过程。氧化磷酸化路径上的基因在营养生长向发育过渡的过程中显著上调,说明该通路上的基因参与配子体从营养生长向发育的调控,维持配子体细胞向配子过渡的物质和能量代谢,维持呼吸作用的正常运行。过氧化物酶路径上富集的基因从休眠期到营养生长出现显著下调,可能参与配子体生长发育过程中活性氧代谢的调控。