脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种严重的中枢神经系统性疾病,损伤后会造成脑和脊髓的信息传递障碍,不同程度和部位的脊髓损伤会导致上肢或下肢的瘫痪,严重的影响了患者的日常生活,因此脊髓损伤后肢体的功能性恢复也成为主要的临床治疗评价标准。针对脊髓损伤后的治疗方法很多,包括电刺激治疗、干细胞移植、药物干预等,但仅有为数不多的治疗方法可以取得有效的功能恢复,而绝大多数并不能恢复瘫痪的肢体的运动功能。近年来电刺激在治疗脊髓损伤中的应用已取得了实质性的进展,研究表明这种方法可以增强脊髓神经元的电活动,并且能使脊髓损伤后肢体得到功能性的恢复。但面临的挑战是如何选择刺激参数,以及探寻其潜在机制。因此在本课题中重点研究的问题是针对闭环性电刺激模式下的刺激参数的选择,以及这种电刺激模式对脊髓神经环路的重塑是否有促进作用。第一部分闭环性电刺激系统的建立和有效刺激频率的选择实验一正常小鼠脊髓闭环电信号发放特点目的:通过对深度麻醉状态下的正常小鼠植入电极,来检测脊髓闭环电信号的发放特点,从而确定脊髓损伤后小鼠闭环电刺激的参数。方法:1.利用荧光金（fluorogold,FG）逆行标记方法,明确胫骨前肌（tibialis anterior,TA）功能相关的运动神经元在脊髓的分布范围;2.对体重在22-25 g的C57 BL/6J雄性小鼠分别进行TA表面电极及脊髓L2-L4节段硬膜外电极的植入（电极可刺激也可接收信号）;3.分别在小鼠脊髓硬膜外和TA给予不同强度电刺激来检测小鼠脊髓闭环电信号的发放特点,并通过鞘内注射河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）来鉴定检测到的电信号成分;4.统计分析接收到的电信号并确定闭环性电刺激参数。结果:1.FG逆行标记与TA功能相关运动神经元分布范围在脊髓的L2-L4节段。2.成功植入小鼠硬膜外电极和TA肌肉表面电极。3.给予不同强度的硬膜外电刺激,检测到硬膜外电刺激的阈值为300 m V。4.在给予小鼠硬膜外400 m V,1 Hz,波宽在0.2 ms的阈上刺激后,可检测到的波形成分包括潜伏期和脊髓反射（早期、中期和晚期）两个部分。5.分别给予不同强度的硬膜外电刺激（300 m V、400 m V、500 m V、600 m V、700 m V、800 m V、900 m V和1000 m V）后,可见到从400 m V开始脊髓反射出现中、晚期波形,在刺激强度达到600 m V时,中、晚期波形达到峰值,随后随着刺激强度的加大波形振幅减弱。电刺激后整个传导时间不大于30 ms。6.鞘内注射TTX后,可见到脊髓反射中、晚期波形的减弱和消失。7.TA肌肉表面电刺激的阈值为900 m V,传导时间不大于20 ms。结论:小鼠脊髓硬膜外刺激在不同强度下能够诱导出不同的脊髓反射,其中早期脊髓反射可能与直接刺激传出神经有关,而中、晚期脊髓反射可能由于脊髓内部多级神经元的参与而产生。由此我们不仅成功建立了闭环性刺激系统而且得到了具体的闭环刺激参数,即硬膜外刺激强度为400-600 m V,经过50 ms开始发放胫骨前肌肌肉表面刺激,强度为1000 m V。实验二闭环性电刺激对于脊髓损伤后小鼠有效刺激频率的选择目的:通过在脊髓损伤小鼠上建立闭环性电刺激系统,探索对于脊髓损伤后小鼠最有效的刺激频率。方法:1.对体重在22-25 g的C57 BL/6J雄性小鼠进行脊髓T9全横断损伤模型;2.分别在小鼠脊髓硬膜外L2-L4节段和TA植入电极,连接闭环刺激系统;3.给予脊髓损伤后1周的小鼠为期3周频率分别为1 Hz、5 Hz、10 Hz、20 Hz、30 Hz和40 Hz的闭环性电刺激;4.在进行闭环性电刺激前1周,刺激后1周和3周分别利用Biopac对小鼠的TA肌电信号（EMG）进行采集;5.利用Matlab对于Biopac采集到的数据进行量化分析。结果:1.成功建立小鼠脊髓T9全横断损伤模型。2.实现了小鼠脊髓硬膜外电极和肌肉表面电极长期植入的可能性。3.脊髓全横断损伤1周以后,各组小鼠的肌电信号出现中、晚期脊髓反射波形的消失,只有早期波形的存在。4.未经闭环性电刺激的小鼠,在损伤4周后仍未能诱发出中、晚期脊髓反射波形。5.经过1 Hz、5 Hz、30 Hz和40 Hz闭环性电刺激3周的小鼠肌电信号检测结果和未经闭环性电刺激组一致,即没有诱发出中、晚期脊髓反射。6.经过10 Hz和20 Hz闭环性电刺激的小鼠,3周后肌电信号的检测结果显示,在有早期脊髓反射存在的同时,中、晚期脊髓反射也得到了一定程度的恢复。结论:闭环性电刺激对于脊髓损伤后小鼠有效的刺激频率为10 Hz和20 Hz。第二部分特定频率的闭环性电刺激对脊髓损伤后小鼠运动神经环路的重塑目的:鉴于第一部分已经确定的特定闭环性电刺激频率,第二部分旨在探讨特定频率的闭环性电刺激对小鼠脊髓运动神经环路的功能性重塑。方法:1.利用r AAV-Retro-EGFP逆行标记TA功能相关运动神经元,观察其在脊髓腰段的数量和分布情况;2.利用Imaris软件分析各组小鼠被标记到的TA功能相关运动神经元及其树突密度和体积的变化情况;3.利用CUBIC 3D透明技术分析各组小鼠TA功能相关运动神经元在脊髓的整体分布;4.利用柔性压力传感器装置检测特定频率闭环性电刺激后小鼠后肢TA的运动情况。结果:1.在r AAV-Retro-EGFP逆行标记3周之后,免疫荧光复染可见,与TA功能相关的运动神经元主要分布在脊髓灰质中间靠外侧部位。2.观察各组小鼠染色结果发现,未经闭环性电刺激组小鼠,神经元数量（冠状面和矢状面）明显低于对照组。而特定频率（10 Hz和20 Hz）闭环性电刺激组小鼠运动神经元数量要明显高于其它频率刺激组（1 Hz,5 Hz,30 Hz和40 Hz）。3.特定频率（10 Hz,20 Hz）闭环性电刺激组小鼠,在刺激结束后神经元整体密度的平均值（Intensity mean）显著低于损伤组,而这些结果和对照组比较没有统计学差异;同样,在对神经元周围树突密度进行统计中也发现,经特定频率（10Hz,20 Hz）闭环性电刺激组小鼠,运动神经元树突密度的平均值（Intensity mean）也显著低于损伤组,而与对照组比较没有统计学差异。4.对运动神经元和周围树突的整体体积做了量化比较得到的结果是,在经过特定频率（10 Hz,20 Hz）闭环性电刺激后,神经元体积显著大于损伤组,而与对照组比较没有统计学差异;而对神经元周围树突的体积量化结果显示,在经过特定频率（10 Hz,20 Hz）闭环性电刺激后,运动神经元树突体积明显大于损伤组,而与对照组比较没有统计学差异。5.CUBIC 3D透明结果显示,10 Hz闭环性电刺激组小鼠,脊髓L2-L4节段支配TA的运动神经元数量显著高于损伤组。可见到运动神经元之间连接增多,神经元形态饱满,但是数量没有达到对照组水平。6.柔性压力传感器装置检测到10 Hz闭环性电刺激组小鼠相比较对照组小鼠后肢胫骨前肌有一定收缩功能的恢复,而未经闭环性电刺激组小鼠未见到TA任何收缩功能的恢复。结论:特定频率的闭环性电刺激（10 Hz,20 Hz）能够促使脊髓损伤后小鼠脊髓局部神经环路的改变,增加功能相关运动神经元的活性,促进小鼠特定运动功能的恢复。第三部分脊髓全横断损伤前后脊髓灰质内神经递质代谢情况分析及对TA运动功能相关的运动前神经元的探索目的:鉴于特定频率的闭环性电刺激后会影响脊髓运动环路,但其影响的可能机制及运动前神经元是否参与其中还有待探讨。此部分旨在探讨脊髓灰质内神经递质代谢情况及支配TA运动功能的运动前神经元的分布,为后续的研究打下基础。方法:1.利用磁共振波谱分析（MR spectroscopy,MRS）脊髓全横断损伤前后损伤以下节段脊髓灰质内神经递质代谢情况;2.狂犬病毒（Rabies virus,RV）逆向跨单突触标记TA功能相关运动前神经元在脊髓灰质内分布情况。结果:1.通过对小鼠脊髓进行多方位高分辨率T2 WI结构像成像,在结果中可清晰的看到小鼠L2节段脊髓形态,脊髓内部灰质和白质成分明显划分。2.对选定的位置进行STEAM处理。小鼠脊髓神经递质代谢的波谱分布特点:其中最高峰为胆碱峰（Cho）,包括磷脂酰胆碱（PCho）和甘油磷酸胆碱（GPC）。其次包括:谷氨酸（Glu）,谷氨酰胺（Gln）,γ氨基丁酸（GABA）,甘氨酸（Gly）等。3.T9脊髓全横断损伤以后,损伤以下L2节段脊髓灰质内谷氨酸含量相对于肌酸的代谢物率较对照组呈上升趋势。4.经RV标记到的和TA运动功能相关的运动前神经元所处的位置主要分布在同侧的Rexed板层的Ⅵ,Ⅶ,Ⅹ层。而对侧的运动前神经元集中在Rexed板层的Ⅶ层和腹内侧的Ⅷ层。结论:1.脊髓损伤后,损伤节段以下神经元的损伤会带来谷氨酸释放量增多,从而造成伸肌兴奋性增强导致痉挛的发生;2.脊髓运动前神经元可以作为后续研究的重点,包括其和运动神经元之间的环路连接。