本研究对华南农业大学禽病学教研室分离并保存的NDV分离株35/GD/05/Ch的主要生物学特性进行了研究。毒力鉴定结果显示，该毒株的鸡胚平均致死时间(MDT)为57h，脑内接种指数(ICPI)为1.788，静脉接种指数(IVPI)为2.53，对鸡的半数致死量(LD50)为10-6.25/0.2mL，各指标均表明该毒株为强毒力毒株。 利用自行设计的引物成功对实验毒株35/GD/05/Ch的F基因进行了RT-PCR扩增，并将扩增片段与pMD18-T载体相连构建重组质粒后测序，对其3末端375bp的核苷酸序列进行同源性分析并进行基因分型。结果表明该毒株为基因Ⅶ型，为目前我国主要流行基因型。35/GD/05/Ch F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸的序列分析结果为112Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe117，完全符合NDV强毒株如Australia-Victoria、F48E9、herts33及IT129-88等经典毒株在该区域的氨基酸序列特征。 根据核苷酸序列推导其氨基酸序列，利用DNAStar软件包中Protean分析分离株F蛋白质的特征。分析结果显示，该蛋白空间结构以β折叠为主，具有较好的柔韧性；表面可能性特别低，大部分以疏水区表现；分析其抗原性指数发现，该蛋白主要存在3个抗原位点集中的区段：30aa-120aa、150aa-200aa和360aa-500aa。利用Insight Ⅱ基因工作站的MODELER程序和同源模建技术模拟了该毒株F蛋白单体分子三维空间结构和F蛋白分子表面抗原位置的分布。从立体空间构象来看，F蛋白的空间结构大致分为头部、茎部和柄部3部分。根据表面抗原分布位置可知，F蛋白有5个线性B细胞表位肽段，分别为：P1(68-75aa)、P2(100-105aa)、P3(171-183aa)、P4(375-380aa)和P5(438-454aa)。其中P1、P2位于F2亚单位，P3、P4位于F1亚单位，P5则位于F1亚单位七肽重复序列HR2区含有的一段跨膜区上。除了5个线性B细胞表位肽，该毒株的F蛋白上至少还有7个抗原决定簇位点(72、74、75、78、79、171、343和388)，第72位和343位两个位点分别位于F2亚单位主要疏水区和F1亚单位C末端富含半胱氨酸区。 设计引物通过PCR扩增了两段含有多个抗原位点的多肽片段F1和F2，通过双酶切定向克隆到原核表达载体pET32a，获得重组质粒pET32a-F1和pET32a-F2以及两个片段串联后克隆的重组质粒pET32a-F3。对其测序确认读框正确后，转入大肠杆菌Rossetta中诱导表达并进行纯化。在IPTG的诱导下，三种融合蛋白都得到大量表达，SDS-PAGE薄层扫描分析表明三个重组蛋白大小依次为30kDa、34kDa和43kDa；最高表达量占菌体总蛋白量依次约为46％、43％和26％。Western Blot印迹分析表明，表达产物与兔抗NDV阳性血清有明显阳性反应，三个蛋白均具有较好的免疫反应性。F1、F2及F3片段在pET32a(+)上表达后，F1和F3融合蛋白几乎完全以包涵体形式存在，F2融合蛋白也有90％左右以包涵体形式存在。由于两个重组的融合蛋白都带有6×His标签，本研究采用Ni2+螯合柱亲和层析将三个融合蛋白用镍柱在变性的条件下进行纯化，结果得到纯度较高的纯化蛋白。用表达的重组蛋白加免疫佐剂制备为油乳剂油苗后经肌肉注射非免疫鸡，免疫2次后可产生水平较高的抗体。用100个LD50强毒株35/GD/05/Ch攻击实验鸡，统计其发病率和致死率，并在攻毒后第7天采棉拭子检测存活鸡的排毒率。结果显示，La Sota免疫组和重组蛋白免疫组F1、F2及F3能产生保护性中和抗体，对亲本毒株的攻击能提供一定的保护，La Sota免疫组保护率可达19/20，重组蛋白免疫组F1、F2及F3的保护率分别为14/20、13/20和14/20，并可以显著地抑制排毒。结合耐过鸡的排毒率，表明F3融合蛋白纯化产物的免疫效果相对较好。本试验结果为进一步研究F蛋白抗原结构域的免疫原性以及保护力从而为ND多表位疫苗研究奠定了基础。