黄连木子叶节组培快繁及性别鉴定研究

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黄连木(Pistacia chinensis Bunge)属于漆树科(Anacardiaceae)黄连木属(Pistacia L.),雌雄异株,种子含油量较高,是制造生物柴油原料的良好能源树种;根、茎、叶、树皮可入药,具有重要的经济价值。随着研究的深入,黄连木资源不断的被开发利用,其应用范围也在不断的扩大,市场需求量剧增,仅靠自然繁殖已不能满足对黄连木资源的需求,因此开展其无性快繁技术的研究可以缩短培养的周期,提供大量种苗,从而能降低生产成本以快速提高经济效益,具有潜在的工厂化应用前景。植物性别鉴定的研究不仅在理论上具有重要的意义,在实践上能够根据需要合理的控制雌雄株的比例,更大限度的提高预期经济效益。本文以黄连木种子及其雌雄株叶片为材料,采用植物组织培养技术对其进行了快繁;另外,通过采用同工酶及RAPD分析技术分别对黄连木雌雄株进行了差异比较分析,以期为研究黄连木性别分化机制提供依据,在实践上对黄连木性别早期鉴定提供可靠的指标。主要研究结果如下:1.黄连木子叶节组培快繁研究。通过对黄连木子叶节组培快繁的研究表明:最佳芽诱导培养基为1/2 WPM+6-BA 2.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1,丛生芽的平均诱导率可达到75.0%,每外植体出芽数为4.3个,芽长平均值为0.77 cm;最佳增殖培养基为1/2 WPM+6-BA 4.0 mg·L-1+ IBA 0.1 mg·L-1,平均增殖系数达到9.0;最佳生根培养基为1/2 WPM+IBA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.02 mg·L-1,生根率可达到100%。2.黄连木同工酶性别鉴定研究。对黄连木过氧化物酶同工酶分析结果表明,雌树有8条特异酶带,雄树有2条特异酶带;酯酶染色结果显示:雄树有9条特异酶带,雌树有1条特异酶带;多酚氧化酶染色结果显示:雄树有5条特异酶带,雌树有2条特异酶带。为了进一步探讨同工酶鉴别雌雄的准确率,本试验选用10株不同年龄的黄连木进行检测,结果显示:这三种同工酶的正确率都在70%以上,其中多酚氧化酶的正确性可达100%。本试验结果表明:黄连木雌雄株叶片在同工酶谱上,存在着与性别相关的酶带,雌雄株间的差异酶带均有一条以上,可作为黄连木雌雄株性别鉴定的依据。3.黄连木RAPD性别鉴定研究和SCAR标记的转化。随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术对黄连木雌雄株的性别差异进行了比较研究。本试验通过对常规CTAB提取DNA方法的改良,建立了适用于黄连木叶片DNA提取的方法,改良CTAB法提取的DNA电泳条带清晰无RNA等污染,OD260和OD280比值在1.8左右,RAPD扩增条带清晰、无弥散现象、亮度均一。并对RAPD-PCR扩增体系进行了优化,优化后的扩增体系条带清晰、无拖尾现象。通过对200条RAPD随机引物的筛选,筛选出6条能在雌雄株基因池之间扩增出差异条带的引物,对特异条带分别进行了克隆、测序。根据序列分析结果将特异片段分别转化为重复性和稳定性更好的SCAR(sequence characterized amplified regions)标记。经验证,其中与雌株相关的550bp的SCAR引物S1420-11C,能够很好的运用于黄连木的性别鉴定。
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