新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxie-ischemic encephalopathy, HIE)是围生期各种因素引起缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic Brain Damege, HIBD)所导致的脑部病变,可导致新生儿早期死亡、脑性瘫痪、发育障碍和癫痫等脑损伤综合征。对此类疾病的治疗至今仍为世界性的医学难题。HIBD是HIE、脑性瘫痪、发育障碍和癫痫等脑损伤疾病的关键环节,如何有效改善HIBD所致的病理状况一直是医学界研究的重要内容之一近二十年来,针灸在治疗新生儿缺氧缺血性脑病后遗症中的脑瘫和儿童精神发育迟滞方面,取得了一些成效,针灸在治疗脑瘫领域展现出很大的发展空间。针灸治疗HIE具有整体调节的优势,且简、便、廉、效,安全无毒副作用,能够长期进行。随着研究的深入,一些学者发现年龄较小的患儿接受针灸治疗的效果较显著,因此萌生了在新生儿期即对HIBD的患儿进行针灸治疗的想法。因此,本文在大量研究古代及现代文献的基础上,探索针灸治疗HIBD导致的脑损伤相关疾病的机理,遵循随机对照的原则设计并实施针刺调节HIBD模型大鼠行为学以及神经保护因子BDNF、EPO表达的研究。研究目的通过建立宫内窘迫HIBD的大鼠模型,观测正常组、模型组和针刺干预组大鼠的体重、行为学和大脑皮质中神经保护因子BDNF、EPO的表达变化,来探讨针刺不同介入时间对HIBD新生大鼠脑部微环境的影响,为临床上针刺介入治疗HIBD导致的脑损伤相关疾病提供参考。实验方法实验一：通过钳夹孕鼠子宫动脉控制新生大鼠在孕鼠子宫内缺氧缺血的时间,建立宫内缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的大鼠模型,参照Apgar评分观察正常组、假手术组和模型组新生大鼠出生后不同时间的体重、行为学改变及脑组织HE染色变化。实验二：实验分正常组、假手术组、模型组、针刺1组、针刺2组。孕鼠自然分娩的幼鼠为正常组；行剖宫产而不作缺氧缺血处理的幼鼠为假手术组；按照实验一的造模方法,制造宫内窘迫HIBD的模型大鼠,随机分为模型组、针刺1组、针刺2组,模型组不针刺；针刺1组造模后第14天开始针刺,针刺1组又再随机分为21天处死组(D21)、28天处死组(D28)、35天处死组(D35)；针刺2组造模后第28天开始针刺,针刺2组又再随机分为35天处死组(E35)、42天处死组(E42)、49天处死组(E49)。对到达预定观察点的大鼠经进行旷场中央格行为学评估后,处死,取脑组织,置入10%中性甲醛溶液中固定,进行脱水、浸蜡、包埋、切片,采用免疫组化法检测大鼠大脑皮质中BDNF的表达。实验三：方法同实验二,对到达预定观察点的大鼠进行旷场水平格行为学评估后,处死,取脑组织,置入10%中性甲醛溶液中固定,进行脱水、浸蜡、包埋、切片,采用免疫组化法检测大鼠大脑皮质中EPO的表达。结果实验一：(1)造模组体重较轻,正常组体重较重,造模组大鼠10次翻身试验成功次数较正常组和假手术组少,差异有统计学意义(P<0.05)：造模组翻身实验所需平均时间较正常组和假手术组长,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)新生大鼠出生第14天悬吊试验中,模型组坚持悬吊时间比正常组、假手术组坚持悬吊的时间短,但差别无统计学意义(P>0.05)。新生大鼠出生第14天斜坡试验中,造模组完成试验的时间长于正常组和假手术组,与正常组的差异有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠出生14天在旷场箱中走出中央格时间有一定的差异,其中造模组走出中央格的时间最长,但与正常组和假手术组的差异无统计学意义(P>0.05)：各组大鼠出生14天在旷场箱中3min内经过的水平格格子数目有一定的差异,造模组大鼠在3min内走的格数最少,但与正常组和假手术组的差异无统计学意义(P>0.05)。(3)各组大鼠出生21天均有神经元死亡，随时间推移,正常组和假手术组生理性神经元死亡减少，而造模组病理性神经元死亡未改善并持续加重,49天时造模组和正常组、假手术组大脑皮质病理改变有明显区别,造模组大鼠符合缺氧缺血性脑损伤病理改变,实验二：(1)21d时,与其它组比较,模型组大鼠中央格时间最长,正常组大鼠中央格时间最短,假手术组中央格时间比正常组稍长,针刺1组中央格时间在模型组和假手术组之间,模型组中央格时间与正常组、假手术组、针刺1组的中央格时间差异均有统计学意义(P<0.05)；28d、35d、42d、49d时,模型组大鼠中央格时间都是最短；28d、35d、42d、49d时,其与其余各组大鼠中央格时间差异均无统计学意义(P>0.05)；正常组、假手术组、模型组、针刺1组大鼠中央格时间随出生天数的增加均呈减少趋势。(2)21d时,与正常组、假手术组、针刺1组的BDNF表达比较,模型组大鼠BDNF的表达最少,其差异均有显著的统计学意义(P<0.01),说明针刺1组在宫内窘迫造模的基础上经针刺干预,BDNF表达有所增加；28d时,模型组大鼠BDNF的表达仍最少,与假手术组大鼠BDNF的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)；35d时,模型组大鼠BDNF的表达与其余各组比较,均无统计学意义(P>0.05)：42d时,正常组大鼠BDNF的表达最多,与其余各组比较,均有显著的统计学意义(P<0.01)；49d时,模型组大鼠BDNF的表达仍最少,但与其余各组比较,均无统计学意义(P>0.05)。实验三：(1)21d时,与其它组比较,模型组大鼠水平格得分最小,针刺1组大鼠水平格得分最大,假手术组和正常组大鼠水平格得分在模型组和针刺1组之间,模型组大鼠水平格得分与正常组、假手术组大鼠水平格得分差异均有统计学意义(P<0.05),与针刺1组的大鼠水平格得分差异有显著统计学意义(P<0.01)；28d、35d、42d时,模型组大鼠水平格得分仍是最小；28d时,其与正常组大鼠水平格得分差异有显著统计学意义(P<0.01)；35d时,其与假手术组、针刺2组大鼠水平格得分差异均有统计学意义(P<0.05)；42d时,其与其余各组大鼠水平格得分差异均无统计学意义(P>0.05)；49d时,模型组大鼠水平格得分最大,与正常组大鼠水平格得分差异有统计学意义(P<0.05)。(2)21d时,与正常组、假手术组、针刺1组比较,模型组大鼠EPO的表达最少,其差异均无统计学意义(P>0.05),说明针刺1组在宫内窘迫造模的基础上经针刺干预,增加了EPO的表达；28d时,正常组大鼠EPO的表达最少,与其余各组大鼠比较,差异均有显著的统计学意义(P<0.01)；35d时,针刺1组大鼠EPO的表达最少,模型组大鼠EPO的表达与正常组比较,有统计学意义(P<0.05),与针刺1组、针刺2组比较,有显著的统计学意义(P<0.01)；42d时,模型组大鼠EPO的表达最少,与正常组比较,有统计学意义(P<0.05),与假手术组和针刺2组比较,有显著的统计学意义(P<0.01)；49d时,模型组大鼠EPO的表达仍为最少,与其余各组比较,均有显著的统计学意义(P<0.01)。结论1、宫内窘迫HIBD的模型大鼠在行为学及HE病理切片上与正常组、假手术组大鼠有有一定差异,同时观察行为学及HE病理切片可较好评价宫内窘迫HIBD大鼠模型是否成功；2、正常组、假手术组、模型组、针刺1组大鼠中央格时间随出生天数的增加均呈减少趋势,其中模型组大鼠21d时中央格时间最长,28d、35d、42d、49d时中央格时间都是最短；21d、28d、35d、42d时模型组大鼠水平格得分仍是最小；49d时模型组大鼠水平格得分最大。这提示模型组大鼠早期主要以行动障碍为主,而中后期可能向大脑控制失调的多动、情感障碍发展。3、针刺组大鼠脑组织BDNF的表达在21d、28d、35d、42d、49d均比模型组多,其表达具有时限性,在21d、49d增加较为明显,提示针刺可促进HIBD模型大鼠脑组织BDNF的表达,针刺干预应该选择时机进行；针刺在21d、42d、49d时点可增加HIBD模型大鼠脑组织EPO的表达,42d增加较为明显,提示针刺干预应该选择时机进行。综合分析,21d、42-49d针刺能促进HIBD的模型大鼠BDNF和EPO同步增加,为较好的针刺时机。