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研究背景复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)的定义为两次及两次以上的宫内妊娠后发生的胎儿丢失。其病因复杂且缺乏特异性的临床表现。并且,约有50%的复发性流产患者的病因无法查明。既往已有研究表明,滋养层细胞的功能异常可能参与了复发性流产的病理过程。NEDD8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8)是一种类泛素蛋白,它通过类似于蛋白泛素化的方式与底物蛋白结合。这一过程被称为neddylation。NEDD8能与其底物cullin通过共价键结合,激活泛素化E3链接酶Cullin-RING ligase(CRL)复合体,促进CRL复合体的底物蛋白泛素化进程,从而参与了细胞内稳态的调节。在女性生殖系统中,Cullin家族成员已被报道在母胎界面表达,且在早期胚胎发育、滋养层细胞的增殖、侵袭迁移等过程中发挥一定的作用。我们推测,NEDD8介导的neddylation过程参与滋养层细胞的增殖与分化的调节,但目前尚无相关文献报道。研究方法本课题收集了正常健康对照(HC)人工流产和RSA患者清宫术后的早孕期绒毛组织,对绒毛中NEDD8的蛋白、m RNA的表达情况进行了WB、Q-PCR、组织免疫荧光(IF)等分析。利用Ki67免疫组化染色、β-半乳糖苷酶组织原位染色对绒毛滋养层细胞的增殖及衰老情况进行检测。对于机制研究,本课题利用neddylation抑制剂MLN4924、si RNA等处理,在体外培养的绒毛扩张组织、滋养细胞系Jeg-3、HTR8-S/Vneo(HTR8)细胞中进行了一系列功能与表型分析,通过CCK8,P-H3和Ki67染色等方法检测细胞增殖水平。另外,本研究收集并培养了人滋养干细胞(trophoblast stem cells,TS cells),通过免疫荧光及流式细胞技术证实了细胞的来源及纯度。并且通过诱导分化证实了TS细胞向绒毛外滋养层细胞(extravillus trophoblast,EVT)及合体滋养层(syncytiotrophoblast,ST)的双向分化能力。利用TS体系进行了滋养细胞分化的研究,观察neddylation对其分化的影响。研究结果首先,本研究在HC的绒毛组织中对NEDD8进行免疫荧光染色。结果显示,NEDD8在漂浮绒毛和锚定绒毛中具有增殖能力亚群中高表达。接下来,将不明原因复发性流产患者与正常对照的绒毛组织的neddylation水平进行了比较,发现RSA绒毛蛋白neddylation水平较低,其中,cullin1(CUL1)的neddylation被抑制的情况最为明显,并且有其底物p21累积的现象。另外,免疫荧光共染结果显示:RSA的绒毛组织中,NEDD8在锚定绒毛的d CCT中有出核并在胞浆累积的现象。以上的现象提示,NEDD8在RSA患者中存在活性与定位的改变。在滋养细胞系中,利用NEDD8激活酶(NAE)抑制剂MLN4924特异性阻断蛋白neddylation过程,可观察到:MLN4924可造成滋养细胞p21的累积,导致NEDD8蛋白从与cullin结合的状态(90kd)转变为游离状态(9KD)。同时,免疫荧光和核质分离实验也提示:在neddylaiton抑制的情况下,游离型NEDD8在胞浆中累积。这一结果与临床样本中观察到的结果相符。进一步证实RSA绒毛滋养细胞中NEDD8定位改变与neddylation抑制有关。另外,RSA绒毛的增殖能力显著下降,CCT细胞衰老明显增加。在体外绒毛扩张实验中也发现,MLN4924能显著抑制绒毛的生长。进一步的机制研究结果显示,在利用si RNA敲降p21之后,MLN4924导致的细胞增殖的抑制作用可被挽救。由于在复发性流产绒毛组织的d CCT,即EVT的前体细胞中观察到了NEDD8蛋白定位的改变,推测异常的neddylation对滋养细胞的分化也有一定的影响。本研究提取并培养了滋养干细胞(TS),在TS向EVT分化的过程中,若加入MLN4924抑制neddylation,可导致分化过程受到抑制,表现为EVT特异性基因如HLA-G等的表达水平显著下降,而细胞滋养层的特异性表达的cadherin 1有上升的趋势。另外,GATA3作为调节滋养层细胞可塑性的关键转录因子,同时也是HLA-G表达的上游分子,其表达在neddylation抑制时也呈下降趋势。对相应的机制的进一步研究的结果显示:p21的累积现象作为neddylation抑制的直接结果,其发生在GATA3和HLA-G的下降之前,敲降p21上游cullin1也可导致HLA-G表达下降,而p21敲降能一定程度上缓解MLN4924造成的HLA-G与GATA3的降调以及细胞衰老现象,提示neddylation抑制造成的p21累积可导致细胞衰老,从而影响上述滋养细胞可塑性与分化调控因子的表达。研究结论结合临床病例及体外功能实验,本研究发现:异常neddylation导致的p21累积可通过抑制滋养细胞增殖和EVT的分化影响早孕期胎盘的功能,从而参与不明原因复发性流产的病理过程。