第一部分McAb-ATR不影响Gq和Gi2/i3信号通路的机制研究目的:AT1R是具有七个跨膜结构GPCRs,在心血管疾病如高血压,冠心病,心力衰竭的发展中都起到非常重要的作用。当有偏向性配体与GPCRs结合时,它们可能在功能上具有选择性或者偏向于G蛋白依赖性途径（Gs,Gq,G12/13,Gi2/i3）或G蛋白非依赖的信号传导途径（beta-arrestin1/2）。本部分主要目的是研究当McAb-ATR与AT1R结合后,McAb-ATR与AT1R结合的关键位点和性质,McAb-ATR对胞内信号途径Gq,Gi2/i3,Ca2+的影响,以及与ARBs作用机制的不同。另外,我们还在喂食西方饮食（WTD）诱导的载脂蛋白E基因敲除（Apo E-/-）小鼠动脉粥样硬化模型中探讨McAb-ATR对RAS和纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）的影响。方法:给雄性BALB/c小鼠免疫ATRQβ-001疫苗,运用单克隆抗体技术培养出可以稳定分泌McAb-ATR的杂交瘤细胞来制备McAb-ATR。首先在多种工具细胞上转染不同的质粒,运用多种检测方法探究McAb-ATR的作用机制,并与ARBs类药物氯沙坦进行比较。免疫荧光法,酶联免疫吸附试验（ELISA）和AT1R的放射性配体结合试验检测McAb-ATR与AT1R结合的特异性。生物发光共振能量转移测量（BRET）用于分析蛋白质Gq,Gi2/i3与AT1R之间的相互作用。细胞内Ca2+浓度测量检测McAb-ATR对AngⅡ诱导的Gq依赖的胞内Ca2+释放的影响。另外,Apo E-/-小鼠（雄性,7周大）被随机分为四组:对照组（n=13）,20μg McAb-ATR组（n=13）,100μg McAb-ATR组（n=13）和缬沙坦组（n=13）。给Apo E-/-小鼠喂食18周的WTD。将Apo E-/-小鼠接受为期18周的治疗:每天口服5 mg/kg缬沙坦,或者每周向尾静脉注射20μg McAb-ATR,100μg McAb-ATR或磷酸盐缓冲液（PBS）。18周后,使用颈脱位法处死Apo E-/-小鼠,并对Apo E-/-小鼠的血浆PRA和AngⅡ浓度进行检测。ELISA检测Apo E-/-小鼠血清中的PAI-1。所有图像均使用Image-Pro Plus软件进行分析。结果:1.免疫荧光,ELISA和AT1R的放射性配体结合试验结果表明:McAb-ATR与AT1R ECL2的Phe182-His183-Tyr184位点特异性结合,并且McAb-ATR与AT1R的结合不影响AngⅡ与AT1R的相互作用。2.BRET分析结果表明:与氯沙坦相反,McAb-ATR不影响AngⅡ诱导的异三聚体G蛋白（Gq或Gi2/i3）的解偶联。3.细胞内Ca2+浓度测量结果表明:McAb-ATR对AngⅡ诱导Gq依赖的细胞内Ca2+释放没有影响。并且AT1R ECL2的Phe182和Tyr184位点的突变也不会影响Ca2+释放。相反,氯沙坦显着抑制了细胞内Ca2+的浓度。4.在RAS分析中,缬沙坦可以显著引起PRA和AngⅡ浓度的反馈激活。然而在McAb-ATR组中未观察到RAS反馈激活。5.Apo E-/-小鼠血清ELISA检测结果表明McAb-ATR可以明显降低PAI-1的水平,而缬沙坦则不能。结论:McAb-ATR能与AT1R特异性结合,其中AT1R ECL2的Phe182-His183-Tyr184是关键结合位点。与ARBs不同的是,McAb-ATR与AT1R非竞争地结合,而不会影响AngⅡ诱导的异三聚体G蛋白（Gq或Gi2/i3）的解偶联,Gq依赖的细胞内Ca2+释放。McAb-ATR也不会引起RAS反馈激活,并且可以降低PAI-1的水平。第二部分McAb-ATR偏向性调节beta-arrestin信号通路的机制研究目的:第一部分已经探究了McAb-ATR对Gq和Gi2/i3信号通路的作用。本部分主要目的是研究McAb-ATR对胞内信号途径beta-arrestin的作用机制,并与ARBs类药物进行比较。另外,体内体外实验在McAb-ATR对beta-arrestin介导的过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和IκB/NFκB p65信号通路的作用上进行了研究。方法:首先BRET用于分析蛋白质beta-arrestin与AT1R之间的相互作用。蛋白免疫印迹（WB）检测McAb-ATR对AngⅡ或SⅡ-Ang诱导beta-arrestin2依赖的ERK1/2磷酸化的抑制作用。免疫荧光法检测McAb-ATR对AngⅡ诱导beta-arrestin介导的 AT1R内化的影响。另外,Apo E-/-小鼠主动脉和RAW264.7巨噬细胞的WB,免疫荧光和Apo E-/-小鼠主动脉根部斑块的病理切片的免疫组化检测McAb-ATR对PPARγ和IκB/NFκB p65信号通路的影响。结果:1.BRET分析结果表明:与氯沙坦相反,McAb-ATR不影响AngⅡ诱导的beta-arrestin的募集。2.WB分析表明:在AT1R-CHO-K1细胞中,McAb-ATR和氯沙坦都在10分钟时有效抑制了AngⅡ或SⅡ-Ang诱导beta-arrestin2依赖的ERK1/2磷酸化。并且ECL2的Phe182和Tyr184位点的突变也会在10分钟时抑制beta-arrestin2依赖的ERK1/2磷酸化。随后的WB试验证实,在瞬时表达AT1R DRY-AAY突变体的CHO-K1细胞中,McAb-ATR在10-60分钟内有效抑制了AngⅡ诱导的beta-arrestin2依赖性ERK1/2磷酸化。3.共聚焦显微镜结果表明在McAb-ATR组中AngⅡ诱导的beta-arrestin介导AT1R从细胞膜向细胞质中的内化得以保留。但是,氯沙坦减弱了这一现象。4.体内和体外研究结果表明,McAb-ATR不仅增加了PPARγ的表达,还促进了其从细胞质到细胞核的转运。5.McAb-ATR增加IκB的表达并抑制NFκB p65的表达,同时抑制NFκB p65核易位。结论:McAb-ATR和ARBs都可以抑制AngⅡ或SⅡ-Ang诱导的beta-arrestin2依赖的缓慢和延长的ERK1/2磷酸化。然而,与ARBs不同的是,McAb-ATR不会影响AngⅡ诱导的beta-arrestin的募集和beta-arrestin介导AT1R从细胞膜向细胞质中的内化。另外,McAb-ATR在体内外均调节了beta-arrestin介导的PPARγ和IκB/NFκB p65信号通路。第三部分McAb-ATR通过beta-arrestin2途径抑制动脉粥样硬化的机制研究目的:前面两部分已经证明了McAb-ATR可以偏向性调节beta-arrestin途径而对Gq或Gi2/i3途径没有影响,但是beta-arrestin1或2在抗体功能中的作用仍然未知。本部分主要目的主要是通过体内体外实验研究McAb-ATR抑制动脉粥样硬化的作用与beta-arrestin1和beta-arrestin2的关系。方法:运用低密度脂蛋白受体敲除（LDLr-/-）,Arrb1+/+,Arrb2+/+,Arrb1-/-和Arrb2-/-小鼠以及小鼠颈动脉线损伤模型和骨髓移植+西方饮食诱导的LDLr-/-小鼠的动脉粥样硬化模型探究McAb-ATR在动脉粥样硬化模型中作用及机制。Arrb1+/+,Arrb2+/+,Arrb1-/-和Arrb2-/-小鼠（雄性,8周龄）被随机分成16组:假手术组（Sham）:Arrb1-/-组（n=6）,McAb+Arrb1-/-组（n=6）,Arrb1+/+组（n=6）,McAb+Arrb1+/+组（n=6）,Arrb2-/-组（n=5）,McAb+Arrb2-/-组（n=5）,Arrb2+/+组（n=5）和McAb+Arrb2+/+组（n=4）;手术组（Injury）:Arrb1-/-组（n=17）,McAb+Arrb1-/-组（n=16）,Arrb1+/+组（n=14）,McAb+Arrb1+/+组（n=12）,Arrb2-/-组（n=15）,McAb+Arrb2-/-组（n=13）,Arrb2+/+组（n=15）和McAb+Arrb2+/+组（n=13）。手术组接受小鼠颈动脉线损伤手术。各组小鼠分别进行4周每周尾静脉注射PBS或每周尾静脉注射100μg McAb-ATR。四周后,取出小鼠的颈动脉,固定在磷酸盐缓冲的福尔马林中,包埋在石蜡中,然后切片并用苏木精伊红（HE）染色。使用生物显微镜捕获受伤的颈动脉切片的所有图像。使用Image-Pro Plus软件分析受伤的颈动脉上的新生内膜形成。LDLr-/-小鼠（雄性,8周龄）被随机分成8组:Arrb1-/-组（n=7）,McAb+Arrb1-/-组（n=7）,Arrb1+/+组（n=7）,McAb+Arrb1+/+组（n=7）,Arrb2-/-组（n=7）,McAb+Arrb2-/-组（n=7）,Arrb2+/+组（n=7）和McAb+Arrb2+/+组（n=7）。LDLr-/-小鼠用9.5 Gy的辐射进行致死性照射,以消除大多数骨髓来源和内源性骨髓细胞。将来自供体小鼠（Arrb1+/+,Arrb2+/+,Arrb1-/-或Arrb2-/-小鼠）的大约2×106个骨髓细胞注射到每只受辐照的小鼠中。骨髓移植后,各组小鼠喂食6周正常食物饮食,16周WTD。将小鼠进行16周以下治疗:每周向尾静脉注射PBS或100μg McAb-ATR。16周后用颈脱位法处死LDLr-/-小鼠,解剖小鼠并将整个主动脉打开,然后进行中性脂质的油红O染色。然后用油红O和苏木精对LDLr-/-小鼠主动脉根部斑块病变的连续冰冻切片（6μm）进行染色。用数码相机捕获整个主动脉的图像,而在生物显微镜下捕获组织切片的图像。使用Image-Pro Plus软件对所有图像进行了分析。另外,Apo E-/-小鼠主动脉的WB检测McAb-ATR对胆固醇代谢包括ATP结合盒亚家族G成员1（ABCG1）,巨噬细胞表型转化包括诱导型一氧化氮合酶（i NOS）,甘露糖受体C型1（CD206）,几丁质酶样分子3（YM-1）和精氨酸酶1（Arg-1）的影响。并通过小鼠巨噬细胞（RAW264.7）进行泡沫细胞的油红染色实验进一步检测McAb-ATR对胆固醇代谢的影响。WB检测McAb-ATR对来源于Arrb1+/+,Arrb2+/+,Arrb1-/-或Arrb2-/-小鼠（雄性,6周龄）的骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）的胆固醇代谢和表型转化的影响。结果:1.小鼠颈动脉线损伤模型结果表明:在Arrb1+/+,Arrb2+/+和Arrb1-/-小鼠中McAb-ATR可明显改善血管损伤。然而在鼠尾注射McAb-ATR的Arrb2-/-小鼠与注射PBS的Arrb2-/-小鼠之间,并未观察到新生内膜面积的显着差异。2.小鼠骨髓移植+WTD诱导的动脉粥样硬化模型结果表明:McAb-ATR可以明显减少移植Arrb1+/+,Arrb2+/+或Arrb1-/-小鼠骨髓的LDLr-/-小鼠的动脉粥样硬化病变面积。但是,在注射McAb-ATR的移植Arrb2-/-小鼠骨髓的LDLr-/-小鼠和注射PBS的移植Arrb2-/-小鼠骨髓的LDLr-/-小鼠之间,整个主动脉和主动脉根部的斑块病变的面积都没有显着差异。3.Apo E-/-小鼠主动脉的WB检测显示100μg McAb-ATR可以明显增加ABCG1的表达。4.泡沫细胞的油红O染色实验可以更直观地观察到RAW264.7巨噬细胞中的脂质沉积。McAb-ATR明显地抑制了AngⅡ和氧化低密度脂蛋白（ox LDL）导致的巨噬细胞中胆固醇沉积。5.Apo E-/-小鼠主动脉的WB检测显示McAb-ATR能够明显上调Arg-1,YM-1和CD206的表达,同时下调了i NOS的表达。6.WB检测结果表明McAb-ATR明显上调了Arrb1+/+,Arrb2+/+和Arrb1-/-小鼠BMDMs中ABCG1和Arg-1,并下调了i NOS,然而在Arrb2-/-小鼠BMDMs中McAb-ATR不引起ABCG1,Arg-1和i NOS的改变。结论:McAb-ATR通过beta-arrestin2而不是beta-arrestin1途径抑制动脉粥样硬化。McAb-ATR通过beta-arrestin2而不是beta-arrestin1途径调节胆固醇代谢和加速巨噬细胞M2表型转化。