【摘 要】
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恶性疟原虫引起的恶性疟疾是一种严重威胁人类生命健康的传染性疾病。由于缺乏有效的基因编辑手段,缺乏合适的动物模型,导致疟原虫致病机制、疟疾疫苗、药物研发以及抗药性虫株等研究进展缓慢。从基因水平分析疟原虫的耐药性可以加速抗疟疾疫苗和药物的研究,也是恶性疟原虫研究的一个热点和重点。恶性疟原虫的基因组编辑受限于有限的工具和转染与整合效率低。CRISPR/Cas9技术可以快速、经济、高效、特异性地改变疟原虫
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恶性疟原虫引起的恶性疟疾是一种严重威胁人类生命健康的传染性疾病。由于缺乏有效的基因编辑手段,缺乏合适的动物模型,导致疟原虫致病机制、疟疾疫苗、药物研发以及抗药性虫株等研究进展缓慢。从基因水平分析疟原虫的耐药性可以加速抗疟疾疫苗和药物的研究,也是恶性疟原虫研究的一个热点和重点。恶性疟原虫的基因组编辑受限于有限的工具和转染与整合效率低。CRISPR/Cas9技术可以快速、经济、高效、特异性地改变疟原虫基因,从而加速新药靶点的确证和特定基因或者基因家族功能的阐明,以及补充全基因组范围的相关研究,促进疟原虫疫苗及新型抗疟药的研制。酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinase Ⅱ,CK2）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase,STK）均为蛋白激酶。CK2 在细胞生长、增殖、凋亡和癌变等过程中发挥重要的作用。CK2是一个双向特异性的激酶,其中CK2β1、CK2a亚基蛋白可以作为疟疾药物治疗的候选靶标。STK与细胞的生长、分裂、代谢、分化、毒力、致病性密切相关。同时,STK也是一种重要的抗原,可用于开发研制疟疾新型疫苗。在恶性疟原虫中的研究中,STK蛋白和CK2蛋白可能与恶性疟原虫生理功能和致病性相关。本研究选择了 CK2的两个亚基蛋白（CK2β1,CK2α）以及STK蛋白进行加标签基因修饰,并引入突变位点,构建重组虫株,并进行树鼩感染初步实验。实现在没有疟原虫蛋白相应的商业化抗体条件下,利用标签对疟原虫的特定蛋白进行筛选和基因定点突变编辑,从而为深入研究基因功能奠定基础,为疟原虫的其它相关蛋白基因编辑提供技术手段。采用Percoll同步化培养法,获得P.falciparum 3D7环状体期虫体。以P.falciparum 3D7的基因组DNA为模板,PCR扩增获得CK2β1/CK2α/STK基因同源臂,以无模板方式PCR扩增获得HA、HA-Ty1标签,再使用搭桥法将CK2β1/CK2α/STK基因同源臂分别和HA、HA-Ty1、HA-Ty1标签进行融合,引入同义突变的核酸序列,获得 HA-CK2β1,HA-Ty1-CK2α,HA-Ty1-STK 突变基因。以PL6CS质粒为载体,成功构建PL6CS-hDHFR质粒。将HA-CK2β1、HA-Ty1-CK2α及HA-Ty1-STK突变基因分别插入PL6CS-hDHFR质粒,成功构建了 PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK 融合质粒。将 CK2β1/CK2α/STK 基因表达的 sgRNA 序列分别插入对应的PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK融合质粒,成功获得PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK 整合质粒。以PUF1-Cas9质粒为载体,成功构建PUF1-BSD-Cas9质粒。用电击转化的方法将 pUF1-BSD-Cas9 质粒、PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK 整合质粒同时转染进恶性疟原虫3D7虫株,加药筛选,进行PCR鉴定、DNA测序鉴定、Western blotting鉴定和细胞免疫荧光分析（IFA）,成功获得电转的PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK基因重组虫株。结果表明,首次利用CRISPR/Cas9技术能成功且快速地构建恶性疟原虫转基因虫株。PL6CS-hDHFR-CK2β1/CK2α/STK基因重组虫株用树鼩血清或血浆进行体外性培养,成功获得能体外感染树鼩红细胞的基因重组虫株。并用CK2β1/CK2α/STK基因重组虫株分别对未切脾和脾脏切除树鼩进行体内感染实验,结果表明,树鼩不会被3个基因修饰虫株感染。本研究发展及完善了利用CRISPR/Cas9方法快速进行恶性疟原虫基因组改造的方法,为进一步在基因水平研究恶性疟原虫奠定了基础。CK2β1、CK2α、STK重组虫株在树鼩红细胞中进行体外培养获得成功,可为开展其它人疟原虫和动物疟原虫的体外培养研究提供借鉴方法。虽然最终体内实验结果表明恶性疟原虫并不能感染树鼩,但也是恶性疟原虫动物模型研究的尝试和补充。
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