Mitsuaria sp.141壳聚糖酶基因的克隆、表达与酶学分析

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壳聚糖酶是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。使用壳聚糖酶通过降解生产得到的壳寡糖(Chitooligosaccharides,简称CHOS)具有多种生物学功能,在食品添加剂、医药保健、诊断试剂等方面有着非常诱人的前景,并且在工业上使用壳聚糖酶生产CHOS具有高效、环保等优点,因此寻找高效的专一性壳聚糖酶已经成为该领域中研究的热点。目前商业化的壳聚糖酶很少,并且都不能很好的满足工业化生产CHOS的需求。本实验室从南湖边虾壳堆积处筛选到一株诱导型产壳聚糖酶的细菌,经鉴定命名为Mitsuaria sp.141,该细菌在500 mL摇瓶中以适当的条件发酵2d酶活达到4U/mL。基于这一较高的酶活,本研究的主要目的是从该细菌中克隆壳聚糖酶基因,利用基因工程技术实现高效表达,满足工业生产的需求。本研究提取Mitsuaria sp.141的总DNA,通过PCR技术扩增得到壳聚糖酶的编码基因choAl,该基因全长1176 bp, GC含量64.46%,编码391个氨基酸,其中N端80个氨基酸为信号肽。通过BLAST比对,属于糖苷水解酶(GH)80号家族。为了使这一壳聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达,将choA1基因进行以下四方面的改变:(1)去掉信号肽(2)密码子优化(3)GC含量调整(4)降低mRNA二级结构能值,然后将优化前的原始基因序列ori-choA1和优化后合成的序列opt-choA1分别插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的SnaBⅠ与AvrⅡ酶切位点之间,构建重组表达质粒pPIC9K-ori-choA1和pPIC9K-opt-choA1。两个重组质粒用SacⅠ和DraⅠ分别进行单酶切线性化后转化至毕赤酵母,从而得到基因序列和甲醇利用速度不同的四种工程菌株:ori-mut+、ori-must、opt-mut+、opt-muts。这四种工程菌通过G418平板筛选后,得到一株抗性和酶活最高的菌株opt-muts 3#,该菌株采用500 mL摇瓶发酵4 d的粗酶液酶活为55.6 U/mL,采用50 L发酵罐发酵140 h的粗酶液酶活达到422 U/mL。Mitsuaria sp.141所产壳聚糖酶的分子量在SDS-PAGE胶图中表现为33.6 kDa,而从毕赤酵母中纯化的重组酶却显示弥散的条带,分子量为38-55 kDa。质谱分析结果表明该弥散条带中蛋白的氨基酸序列与choA1编码的壳聚糖酶CHOA1的相同,Western blot实验也表明该蛋白是带有his-tag标签的。去糖基化酶验证表明,重组表达的壳聚糖酶被部分N-糖基化,造成电泳时出现弥散的蛋白条带。本课题还研究了Mitsuaria sp.141的壳聚糖酶native-CHOA1和重组壳聚糖酶recombinant-CHOA1的酶学性质,两者的最适反应底物都是胶体壳聚糖,参与酶促反应的最适pH都是5.5, native-CHOA1的最适反应温度为65℃,而recombinant-CHOA1的最适反应温度为55℃。本研究成果得到Mitsuaria sp.141的壳聚糖酶基因,并得到产酶效率较高的重组毕赤酵母菌株,在工业应用上有潜在的价值。
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