碳氮比对变形假单胞菌2-酮基-D-葡萄糖酸合成与代谢的影响

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作为一种安全、高效并具有显著性价比优势的抗氧化剂,D-异抗坏血酸及其钠盐广泛应用于食品、化妆品等工业领域。2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconate,2KGA)作为合成D-异抗坏血酸及其钠盐的前体,目前已成为工业化规模生产的有机酸之一。在2KGA发酵过程中,存在着一种典型的发酵目的产物(2KGA)被其生产菌株代谢利用的现象。本文探讨了碳氮比对变形假单胞菌2KGA合成与代谢的影响,从相关酶的活性、相关酶的基因转录水平、蛋白质组学3个方面的变化对生产菌株代谢利用发酵日的产物的现象进行了阐述,为后续的2KGA代谢机理研究提供一定的理论基础。主要结论如下:  (1)培养基碳氮比是影响变形假单胞菌葡萄糖代谢过程胞外氧化途径/胞内磷酸化途径偏转的关键因子之一。随着发酵培养基碳氮比的提高,变形假单胞菌葡萄糖代谢由胞内磷酸化途径向胞外氧化途径偏转,即碳氮比的提高有助于发酵目的产物2KGA的合成。  (2)变形假单胞菌A46在生长代谢过程中存在分解代谢产物阻遏效应(CCR)。在葡萄糖和2KGA同时存在的情况下,菌体优先利用葡萄糖。  (3)考察了不同碳氮比条件下2KGA合成与代谢过程中相关酶(Gcd、Gad、Glk、KguK、KguD)的活性变化。低碳氮比条件下,发酵过程中葡萄糖脱氢酶(Gcd)的比活随着发酵时间的延长而升高,进入衰亡期后其活性开始降低;高碳氮比条件下,Gcd的比活出现了先升高后下降再升高的现象,且Gcd的活性下降的幅度随着培养基碳氮比的升高而加大。在2KGA合成阶段,葡萄糖酸脱氢酶(Gad)的比活在不断升高;在2KGA代谢阶段,Gad的比活则出现了稳定或下降的现象。另外,碳氮比越高,整体上Gad的比活越小。仅在2KGA代谢阶段才能检测到2-酮基-D-葡萄糖酸激酶(KguK和KguD)的活性。发酵过程中葡萄糖激酶(Glk)的比活呈现先快速升高至最大而后缓慢下降的现象。  (4)低碳氮比条件下2KGA发酵过程中相关酶基因(gcd、gad、kguK、kguD、glk、gnuK)在转录水平上的表达差异与酶活变化趋势基本一致。  (5)低碳氮比条件下变形假单胞菌2KGA合成与代谢两个阶段的蛋白质组共存在42个蛋白差异点(P<0.05,变化倍数大于1.5倍或小于0.67倍)。2KGA代谢阶段有12个蛋白点的表达发生了上调,30个蛋白点的表达发生了下调,利用MALDI-TOF/TOF成功鉴定了其中的34个蛋白点。参与代谢的蛋白质占主体地位。具有转运功能的蛋白点4311可能与2KGA被其生产菌株代谢利用的现象密切相关。
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