【摘 要】
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基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus）是一种以伊蚊为传播媒介的蚊媒病毒,1952年,初次在坦桑尼亚患者的血清中发现并分离。CHIKV主要引起人基孔肯雅热（Chikungunyafever,CHIKF）,是一种急性热性疾病,感染患者主要表现为关节炎、关节痛、发热、肌肉痛及皮疹等。我国于1987年在云南西双版纳初次发现CHIKV感染病例,并分离出该病毒。随着全球贸易及旅游的往来,我国输入性C
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基孔肯雅病毒（Chikungunyavirus）是一种以伊蚊为传播媒介的蚊媒病毒,1952年,初次在坦桑尼亚患者的血清中发现并分离。CHIKV主要引起人基孔肯雅热（Chikungunyafever,CHIKF）,是一种急性热性疾病,感染患者主要表现为关节炎、关节痛、发热、肌肉痛及皮疹等。我国于1987年在云南西双版纳初次发现CHIKV感染病例,并分离出该病毒。随着全球贸易及旅游的往来,我国输入性CHIKV感染病例逐年增加,存在暴发流行的风险。目前还没有研制出可有效针对CHIKV感染的候选疫苗。本研究利用含有基孔肯雅病毒E1基因的重组质粒为阳性标准品,通过优化反应条件,建立CHIKV qPCR检测方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价,利用该方法对云南省部分地区蚊媒携带CHIKV感染情况进行检测,并对阳性样品进行遗传进化分析。对实验室先前构建的携带CHIKVE2基因的重组腺病毒扩大培养后纯化,通过免疫小鼠评价候选疫苗的免疫原性。主要研究结果如下:（1）qPCR结果显示:Ct值与阳性标准品在6.94～6.94×108 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关性为0.997,斜率为-3.571;其检测下限为0.694 copies/μL,且与ZIKV、DENV和JEV等无交叉反应;组内和组间的变异系数均小于2%。对云南省部分地区51份蚊虫样品进行检测,阳性率为3.9%,病毒主要由三带喙库蚊和埃及伊蚊携带传播。综上说明建立的qPCR方法可用于基孔肯雅病毒的检测。（2）对云南部分地区蚊媒携带CHIKV进行分子流行病学调查。遗传进化分析结果说明,CHIKV属于ECSA亚型,与2010年在中国广州分离到的毒株处在同一分支。同源性分析结果说明,扩增到的2株CHIKV毒株与斯里兰卡株（SL-CK-1、SL11131）同源性较高,怀疑该病毒可能通过两种途径传播至我国云南地区:一、病毒经蚊媒由斯里兰卡传播至中国云南地区;二、蚊虫叮咬了已感染CHIKV的患者而带毒。主要氨基酸位点突变分析结果说明,扩增到的2株CHIKVE1基因未发生A226V突变,推测检测到的CHIKV可能不通过白纹伊蚊进行传播。（3）对实验室先前构建的表达CHIKV E2基因的重组腺病毒进行纯化,并配合佐剂A+D免疫小鼠。每周采集小鼠血液并分离血清,利用血清进行以下5项指标的检测:特异性抗体的检测、中和抗体的检测、T淋巴细胞增殖的检测、T淋巴细胞亚型的检测、IgG抗体分型的检测（IgG2a和IgG2b）,以此评价纯化后疫苗的免疫效果。特异性抗体检测结果说明,佐剂（A+D）+rAd-CHIKV-E2免疫组抗体水平是rAd-CHIKV-E2免疫组抗体水平的1.18倍。中和抗体水平检测结果说明,佐剂（A+D）+rAd-CHIKV-E2免疫组中和抗体水平最高可达到1:4096,rAd-CHIKV-E2组中和抗体水平最高可达到1:1024。综合结果表明,携带CHIKV E2基因的重组腺病毒候选疫苗能诱导小鼠产生体液免疫及细胞免疫应答,且配合佐剂免疫后效果更好,说明佐剂（A+D）可以作为重组腺病毒疫苗开发中的候选佐剂。综上所述,本研究采用建立的qPCR检测方法对云南省部分地区蚊媒携带CHIKV情况进行调查及分析,为我国云南省CHIKV疫情的防控提供一定参考;利用纯化后的重组腺病毒免疫小鼠后,检测到较高的特异性抗体及中和抗体,可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫应答,为研究CHIKV重组腺病毒疫苗的开发及佐剂的使用奠定基础。
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