背景:免疫耐受是乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染慢性迁延的重要原因,也是限制慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者获得理想疗效的瓶颈。目前的临床实践中,相当比例的慢乙肝患者经历了长期核苷类药物（nucleos（t）ide anaslogue（s）,NAs）治疗（以下简称“NAs经治CHB患者”）,虽然取得了持续的病毒学抑制但迟迟未能实现HBe Ag血清学转换或HBsAg阴转（临床治愈）,由此带来的停药困难、心理压力、经济和社会负担等问题不容忽视。课题组前期研究发现,聚乙二醇化干扰素（pegylated interferon,Peg IFN）联合/序贯治疗可通过靶向NK细胞、调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）等促进NAs经治CHB患者免疫功能的早期修复,显著提高其临床疗效。NK细胞是天然免疫系统的核心成员以及连接天然免疫和适应性免疫的重要桥梁,除了发挥抗病毒效应,其介导的免疫调节作用也得到越来越多的关注。Treg是机体维持免疫稳态的重要细胞亚群,其介导的HBV特异性T细胞应答缺陷或缺失是CHB迁延不愈的重要机制之一。尽管NK细胞对Treg细胞的调控作用（以下简称“NK-Treg调节通路”）在结核杆菌及肺炎衣原体感染模型中已有报道,NK-Treg调节通路是否参与CHB的疾病进展和治疗预后,相关机制如何,目前国内外尚未有相关研究为之提供线索。方法:基于GEO数据库,收集NAs经治CHB患者在接受Peg IFN-α治疗前和治疗后6小时外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中免疫相关基因的表达谱数据集,通过WGCNA、GO、KEGG、GSEA、ss GSEA等生物信息学工具对Peg IFN-α的免疫调节作用进行分析;纳入OSST（NCT00940485）及Anchor（NCT02327416）两个临床队列的116名NAs经治CHB患者,动态评估其在接受恩替卡韦（entecavir,ETV）治疗或Peg IFN-α治疗过程中外周NK细胞、Treg细胞比例的变化;建立PBMC体外培养体系,通过NK细胞去除、趋化小室、抗体阻断、增殖分化试验等研究NK细胞对Treg细胞的调节效应,明确关键的作用环节及相关分子机制;结合抗病毒治疗方案探讨NK-Treg免疫调节效应与临床疗效之间的关系;建立HBV感染小鼠模型,进一步在肝脏原位验证NK-Treg调节通路的存在及意义。结果:联合公开数据库及生物信息学分析的结果提示,Peg IFN-α治疗可能通过靶向CD8+T细胞、NK细胞、Th2细胞、IFN-γ、JAK-STAT通路、白细胞分化、固有免疫调控、细胞因子和受体的结合等途径调节NAs经治CHB患者的免疫应答状态。针对本课题纳入的病例开展体内外研究发现,NAs经治CHB患者在接受48周Peg IFN-α治疗的过程中其外周NK细胞与Treg细胞的比例具有负相关关系;去除NK细胞或阻断IFN-γ可显著上调Treg细胞的比例、数量、增殖活性以及PBMC中Foxp3的转录水平;NK细胞可抑制初始T细胞向Treg细胞的体外分化过程,并在阻断IFN-γ后部分逆转;Peg IFN-α治疗可以显著上调NAs经治CHB患者NK细胞对Treg细胞的抑制效应,尤其是在48周实现治疗应答（HBe Ag血清学转换和/或HBsAg阴转）或HBsAg下降>0.5 lg IU/mL的患者中更为明显;NAs经治CHB患者NK细胞对Treg细胞的抑制能力与其血清中HBsAg呈线性负相关,且与0周至48周HBsAg的下降幅度呈线性正相关;体外HBsAg可剂量依赖性抑制NK细胞IFN-γ的分泌水平;NK细胞抑制Treg细胞能力较强的患者,其抗原特异性CD8+T细胞应答明显增强,表现为细胞比例及IFN-γ分泌水平的增加,此群患者也更易于在治疗过程中实现HBsAg的显著下降。在HBV感染小鼠模型中,耗竭NK细胞或阻断IFN-γ可导致小鼠肝脏Treg细胞比例和血清HBsAg水平的显著升高。结论:本研究聚焦NAs经治CHB患者的免疫学特征及临床治疗困境,基于生物信息学工具、临床队列及动物模型,结合体内、体外研究多层面论证了HBV感染过程中NK细胞对Treg细胞的免疫抑制作用,揭示了NK细胞通过分泌IFN-γ抑制Treg细胞增殖和分化的新调控机制;提出了Peg IFN-α治疗可以增强NK-Treg调节效应,进而可能通过修复HBV特异性T细胞应答,并改善NAs经治CHB患者的临床疗效和治疗应答。以上研究结论进一步加深了对NAs经治CHB患者免疫特征的认识,丰富了HBV免疫耐受的理论体系,并为直接抗病毒联合免疫调节治疗策略的开发、临床疗效预测标志物的筛选提供了基础和依据。