前言 酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）的发病与多种因素有关。目前研究较多的有：遗传因素；免疫学因素；氧化和缺氧等。其中细胞因子在酒精性肝病发病机制中的作用越来越受到重视。细胞因子参与肝脏炎症的发生，诱发肝细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一种重要的细胞因子，在ALD的发病和发展过程中起到重要的作用。本实验通过建立酒精性肝病大鼠模型，对酒精剂量与血清TNF-α水平及肝细胞凋亡进行研究，探讨酒精剂量与肝损害之间的关系。 实验材料与方法 1．酒精性肝病大鼠模型的制备： 35只雄性Wistar大鼠，体重280-300克，随机分为4组：对照组给蒸馏水灌胃；实验组1、2、3分别予以40％酒精4g·kg^-1d^-1，6 g·kg^-1d^-1，8g·kg^-1d^-1，分三次灌胃，连续二个月。二个月后大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，分离颈外静脉，抽取静脉血，静置后离心，分离血清，-20℃保存。暴露心脏，剪开心包，切开右心耳，左心室插入导管并固定，然后用PBS缓冲液从左心室导管快速注入，经过体循环，从右心耳流出，重复上述过程，直至肝脏颜色由暗红色变为灰白色。将肝叶分离出来，用10％福尔马林溶液固定。肝脏组织经固定、脱水、透明、浸蜡等过程后，制成石蜡包块，于-20℃冰箱中处理12h，制成石蜡切片。 2．检测 （1）干化学法检测血清ALT水平。 （2）放免法检测血清TNF-α的水平。 （3）DNA末端原位标记染色法检测肝细胞凋亡： 肝组织常规石蜡包埋、切片、水化，再用DNA末端原位标记法染色，操作按说明书步骤进行。最后常规DAB显色，苏木素轻染，中性树胶封固。肝细胞凋亡程度判定：细胞核呈棕褐色染色为阳性，无细胞核棕褐色染色为阴性。以凋亡指数（选择2一4个如OX高倍视野，计数200个细胞中阳性细胞，计算公式:凋亡指数（AI）二凋亡阳性细胞数/细胞总数x 100%）反映凋亡程度。 3.统计学处理 实验数据在SsPS10.O建立数据库，用方差分析和Peareon相关分析处理数据。实验结果 1.血清，INF一a和ALT水平: 实验组2和对照组，实验组3组对照组之间有显著的差异，实验组2和实验组3之间有显著的差异;实验组1和对照组之间无显著的差异。血清TNF一a随酒精剂量的增加而增高，ALT也随之增高。 2.肝细胞凋亡的检测: 对照组大鼠肝组织偶见细胞凋亡，着色浅;实验组1即见细胞凋亡增加;实验组2明显增加，实验组3镜下见更广泛细胞凋亡，且着色深。各组间凋亡指数差异有显著性。 3.血清TNF一a水平与肝细胞凋亡的关系: 血清，rNF一a水平与肝细胞凋亡指数均随酒精剂量的增加而逐渐增高，经统计学分析两者之间有相关性。讨论 肿瘤坏死因子主要由巨噬细胞和单核细胞产生，是诱发细胞凋亡的重要因素。，INF一a在肝脏主要由激活的Kupffer细胞产生，并作为一个关键因子参与酒精性肝病的发生与发展。酒精性肝病患者循环中的TNF一a水平升高，且与酒精性肝损伤的生化指标相关。 本研究表明在给予大鼠酒精饲养的过程中，大鼠血清中TNF一a、ALT的含量随着酒精剂量的增大而逐渐升高，同时病理切片显示肝脏的损伤也逐渐加重。TNF一a在ALD发病早期阶段即增加，引起肝损伤的可能机制有以下几方面:（l）TNF一a对肝细胞有直接毒性作用，诱导肝细胞凋亡与坏死;（2） TNF一a触发其它细胞因子的产生，使肝细胞损伤。（3） TNF一a介导肝窦内皮细胞、肝细胞和肝星状细胞表达IcAM一1增强，从而诱导白细胞介导的组织炎症反应，但许多机理尚需进一步阐明川。 本实验通过，rU NEL技术检测酒精性肝病大鼠肝细胞的凋亡。结果表明随酒精剂量的增加，大鼠肝脏细胞的凋亡数目增加。TNF一a水平和肝细胞凋亡之间有正相关性。有研究表明在ALD的发病过程中，凋亡是肝细胞死亡的重要方式，rrNF一a可以介导细胞凋亡。TNF一a的生物学效应是通过细胞表面的 rINF受体引发的。，rNF与TNFRl（ TNF receptorl）结合，可能通过三条途径触发细胞死亡:第一条途径:TNF+TNFRI一TRADD TNF与TNFRI结合并使TN双1胞内三氧化，后者与TRADD（，rNF一receptor-assoeiated death domain）连接。TRADD又可与FADD（Fas一assoeiated deathdomain）和TRA几（TNF receptor一associated factorZ）连接，引起细胞凋亡。第二条途径:TNF+TNFRI一TRADD一 RIP，rNF和TNFRI结合，通过，I卫ADD聚集FJp（RecePtor一interacting Protein）。甩P的C端含一个死亡区，其死亡区优先与TRADD死亡区结合并与，rN FRI发生较弱的连接。并使caspase一2（Ich一1）聚集于RIP，引起细胞凋亡。RIP除与TRADD连接传导凋亡信号外，也激活NF一kB而产生抑制细胞凋亡的作用。第三条途径:以CM作为第二信使的途径TNF诱导细胞凋亡的另一条途径是鞘磷脂酶，其产生的脂质神经酞胺（cerantide，cM）作为死亡信号级联中重要的信号物质，引起细胞凋亡。本研究结果TNF一a水平和肝细胞凋亡之间有正相关性也说明TNF一。在酒精性肝病肝细胞凋亡的过程中起重要作用。结论