Notch信号通路抑制剂DAPT对原代急性白血病细胞增殖及凋亡作用

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【目的】  通过研究Notch信号通路抑制剂DAPT对急性白血病患者骨髓原代白血病细胞增殖和凋亡的影响,进而探讨Notch信号通路在原代急性白血病细胞中的增殖和凋亡作用。  【方法】  1. 实验骨髓样本取材  选择20例确诊为急性白血病的初诊患者病例,诊断分型按照MICM分型。未用化疗药物前取骨髓1~1.5 ml,用抗凝管或EDTA抗凝管抗凝处理,采集后4~6h内用密度梯度法分离或放冰箱4℃冷藏保存,从样本取材到处理时间要求不超过10个小时。  2. 细胞培养与分组:(1)取化疗前的病人骨髓,用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(MNCs),将分离出的细胞加入含有10%FBS的完全培养基,细胞浓度调整为4~10×106/ml。(2)实验分组:① 检测增殖抑制分两组:实验组(DAPT组):加DAPT以1μmol/L浓度处理细胞.,对照组(Control组)加等量DMSO处理细胞,均置于5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养;②检测细胞凋亡分两组:将经淋巴细胞分离液分离的 MNCs 以1×104/mL 接种于96 孔板,每孔100μL,实验组(DAPT组):加1μmmol/LDAPT,对照组(Control组):加等量培养液,均设3个复孔,均置于5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养72 h。  3. MTT法检测细胞增殖抑制率  实验组和对照组分别培养72 h后,每孔加入 5%MTT 溶液,每孔20μl,置CO2 培养箱孵育 4 h,离心弃上清终止培养,加入 DMSO 每孔150μl,于酶标仪 570 nm 读取各孔吸光度 ( A570 ) 值,按细胞增殖抑制率(%)=(1-A570 用药组 /A570 未用药组)×100%计算。  4. 流式细胞术检测细胞凋亡率  收集培养72 h的实验组、对照组细胞,分别用FITC偶联Annexin-V凋亡检测试剂盒处理后用流式细胞术检测细胞凋亡率。  【结果】  1. 标本临床资料:20个实验标本样本均来自广东医科大学住院部初发急性白血病患者骨髓,并根据MICM分型,其中T-ALL:2例,B-ALL:9例,AML:9例。  2. 骨髓单个核细胞形态学的观察:在倒置显微镜下可观察到:骨髓中单个核细胞为圆形或类圆形,细胞大小相对一致,折光性好。  3. Notch信号通路抑制剂DAPT对原代白血病细胞增殖抑制的影响  Notch信号通路抑制剂DAPT对ALL原代白血病细胞增殖抑制的影响:DAPT作用于ALL原代白血病细胞,细胞增殖抑制率较Control组相比明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。  Notch信号通路抑制剂DAPT对AML原代白血病细胞增殖抑制的影响:DAPT作用于AML原代白血病细胞,细胞增殖抑制率与Control组相比,差异无统计学意义(P>0.1)。  4. Notch信号通路抑制剂DAPT对原代白血病细胞凋亡的影响  Notch信号通路抑制剂DAPT对ALL原代白血病细胞凋亡的影响:DAPT作用于ALL原代白血病细胞,细胞凋亡率与Control组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。  Notch信号通路抑制剂DAPT对AML原代白血病细胞凋亡的影响:DAPT作用于AML原代白血病细胞,细胞凋亡率与Control组相比,差异无统计学意义(P>0.1)。  【结论】  1. Notch信号通路抑制剂DAPT可抑制ALL原代白血病细胞的增殖,但对AML原代白血病细胞的增殖抑制未见明显作用。  2. Notch信号通路抑制剂DAPT促进ALL原代白血病细胞凋亡,但对AML原代白血病细胞的凋亡未见明显作用。
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