研究背景:微生物与宿主的共生关系普遍存在于包括人类在内的哺乳动物中,充足的证据表明人体内存在着大量的微生物,这些微生物根据其群落的多样性特定分布于人体各个部分。肠道菌群占据人体微生物的主要部分,与宿主共生共存,从新生儿时期的初始定植到成长过程中的个体特异性分化,肠道菌群与宿主都处于动态平衡和谐的关系中,帮助宿主在抵御病原体的侵害、强化肠上皮屏障、增强消化代谢、促进营养吸收、指导宿主免疫系统成熟以及正常功能运转等方面发挥着重要作用。肠道菌群对于人体行为有着重要的调节作用,大量的临床报道与实验研究都证实了肠道菌群失调会导致包括抑郁与焦虑在内的行为异常。中草药作为中国传统医学代表,因其对疾病的显著治疗效果以及对人类生存和繁衍具有重要贡献而受到高度赞赏。中草药与肠道菌群存在互作作用,研究表明肠道微生物群通过与中草药组分的复杂相互作用在中草药药物疗法中起关键作用。中草药可以改善肠道微生物群的组成,从而改善其功能障碍以及相关的病理状况。逍遥散出自宋朝《太平惠民和剂局方》,包含柴胡,当归,生姜,白芍,茯苓,白术,薄荷,甘草8味中药,具有疏肝解郁、健脾和营的功效。现代临床研究表明中医经典方剂逍遥散可以有效改善抑郁症患者的抑郁状态。本课题前期研究发现逍遥散对于小鼠抑郁样行为有良好的调节作用,但是其具体机制仍不明确,特别是肠道菌群是否参与逍遥散对于抑郁样行为的改善机制有待研究。因此,探究逍遥散是否通过肠道菌群从而改善精神类疾病的行为异常,可以为其提供药理学依据。研究目的:本课题旨在观察逍遥散对于抗生素氨苄西林诱导的肠道菌群失调小鼠异常行为的调节作用,并且对结肠NLRP3-ASC-CASCASE-1信号通路进行研究,探索菌群失调情况下结肠NLRP3-ASC-CASCASE-1信号通路的变化以及逍遥散的调节作用,为逍遥散改善行为异常的生物学基础提供新的思路。研究方法与结果:(1)肠道菌群失调小鼠模型的建立以及行为学评价。方法:采用抗生素氨苄西林干预的方式建立肠道菌群失调模型,将健康雄性C57BL/6小鼠60只随机分为四组,正常组,模型组,逍遥散组和益生菌组,除正常组外,均于造模第1天早上9点开始灌服氨苄西林溶液,给药量为100 mg/kg,灌胃容积为0.1 ml/10 g体重,连续两周,建立肠道菌群失调小鼠模型。逍遥散组灌服逍遥散悬液;模型组灌服等体积等量无菌水;益生菌组灌服益生菌溶液。每日观察各组小鼠的一般状态并称量体重;于实验第0天与14天进行小鼠旷场实验,于实验第14天进行小鼠高架十字迷宫和悬尾实验;于实验第15天盲肠无菌取粪便样本进行16S微生物多态性分析。结果:(1)各组小鼠一般状态结果:实验前1天,各组小鼠精神状态均良好,皮毛光泽、动作灵活、粪便呈球状、干湿适中。实验第14天,模型组小鼠精神状态较差,毛发凌乱、活动减少、粪便变软、不成球状。逍遥散组与益生菌组小鼠精神状态尚可,毛发较整齐而且未见枯黄,动作灵敏、粪便未见异常。正常组于实验前相比无变化。(2)各组小鼠体重结果显示:造模第7天,与正常组相比,模型组、逍遥散组、益生菌组体重较为下降,但差异不具有统计学意义。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠体重低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散组与益生菌组体重整体大于模型组,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。(3)各组小鼠旷场实验结果显示:造模前1天,各组小鼠在旷场实验中五分钟运动总距离经统计学分析无明显差异。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠运动总距离明显低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散组与益生菌组运动总距离则显著高于模型组(P<0.001)。热图显示与正常组相比,模型组小鼠在旷场中活动范围主要集中在外周区域,较少穿越中央区,运动探索欲望较低,静止不动时间明显增长。而逍遥散组与益生菌组小鼠活动范围较广,运动区域包括中央区,探索欲望较高,静止不动时间较模型组明显降低。(4)各组小鼠高架十字迷宫实验结果显示:造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠在5分钟内开放臂运动的距离明显低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散与益生菌组开放臂的运动距离则显著高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。热图结果也显示与正常组相比,模型组小鼠活动范围主要集中在封闭臂。(5)各组小鼠悬尾实验结果显示:造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠在悬尾实验中最后四分钟的不动时间明显高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散与益生菌组开放臂的不动时间则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01)。(6)各组小鼠粪便16S微生物多态性分析显示:造模第14天,通过菌群的多样性分析显示,与正常组相比,在种属水平上,模型组小鼠肠道微生物相较与正常组降低,逍遥散与益生菌组肠道微生物则较模型组增加。PCA主成分分析也显示模型组相较于正常组、逍遥散组以及益生菌组有明显的差异。各组小鼠族水平的相对丰度具体也有差异。(2)肠道菌群失调小鼠结肠炎性病理变化和菌群失调代谢物变化以及逍遥散的调节作用。方法:HE染色法观察结肠炎症病理,ELISA法测定血清、结肠组织以及粪便中内毒素LPS水平,ELISA法测定血清中IL-1β水平。结果:(1)各组小鼠HE染色结肠的病理结果显示:造模第14天,通过HE染色技术分析,正常组结肠组织肠壁结构完整,形态正常。与正常组相比,模型组小鼠结肠组织出现明显的炎性浸润病理改变,包括结肠肠壁变薄,排列无序,空泡变性。逍遥散组与益生菌组则有不同程度的好转。(2)各组小鼠粪便,结肠匀浆液以及血清中的内毒素LPS表达结果显示:造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠粪便、结肠匀浆液以及血清中的内毒素LPS水平明显高于正常组,差异具有统计学意义(粪便:P<0.001;结肠匀浆液:P<0.01;血清:P<0.001)。逍遥散与益生菌组粪便、结肠匀浆液以及血清中内毒素LPS的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(粪便:P<0.001;结肠匀浆液:P<0.05;血清:P<0.01)。(3)菌群失调小鼠结肠NLRP3/ASC/CASPASE-1通路变化及逍遥散的调节作用。方法:采用RT-PCR方法检测小鼠结肠NLRP3、ASC、CASPASE-1m RNA表达;采用免疫组化检测小鼠结肠NLRP3、ASC、CASPASE-1蛋白表达;采用Western Blot方法检测小鼠结肠NLRP3、ASC、CASPASE-1相对蛋白含量。结果:(1)各组小鼠结肠NLRP3、ASC、CASPASE-1m RNA表达结果显示:造模第14天,模型组小鼠结肠NLRP3基因的表达升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散与益生菌组结肠NLRP3基因的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠ASC基因的表达升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散与益生菌组结肠ASC基因的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.001)。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠CASPASE-1基因的表达升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散与益生菌组结肠CASPASE-1基因的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01;P<0.01)。(2)各组小鼠结肠NLRP3、ASC、CASPASE-1免疫组化结果显示:造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠NLRP3的平均光密度显著高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散与益生菌组结肠NLRP3平均光密度则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01;P<0.001)。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠ASC的平均光密度高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。逍遥散与益生菌组结肠ASC的平均光密度则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠CASPASE-1的平均光密度高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散与益生菌组结肠CASPASE-1的平均光密度则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。(3)各组小鼠结肠NLRP3,ASC,CASPASE-1的Western Blot结果显示:造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠NLRP3的蛋白表达高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。逍遥散与益生菌组结肠NLRP3的蛋白表达低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠ASC的蛋白表达高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.01)。逍遥散与益生菌组结肠ASC的蛋白表达低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。造模第14天,与正常组相比,模型组小鼠结肠CASPASE-1的蛋白表达高于正常组,差异具有统计学意义(P<0.05)。逍遥散与益生菌组结肠CASPASE-1的蛋白表达低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.05;P<0.05)。(4)逍遥散含药血清对于LPS诱导的NCM460内毒素损伤模型以及NLRP3炎性小体表达的调节作用方法:细胞分为空白对照组、LPS诱导内毒素损伤模型组(简称LPS模型组)、LPS+NLRP3敲除组、LPS+低剂量逍遥散含药血清组(简称低剂量血清组)、LPS+中剂量逍遥散含药血清组(简称中剂量血清组)、LPS+高剂量逍遥散含药血清组(简称高剂量血清组)。采用LPS(1 mg/L)的方法刺激细胞来模拟菌群失调造成的内毒素损伤模型。低、中、高剂量逍遥散含药血清进行干预。采用CCK8检测细胞活力,采用ELISA测定细胞培养液中IL-1β水平,采用HE染色观察各组细胞状态,采用WB检测各组细胞NLRP3炎性小体表达情况。结果:(1)细胞活力检测结果显示:LPS模型组细胞活力明显低于正常组,差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散中、高剂量含药血清组细胞活力明显高于模型组,差异具有统计学意义(P<0.001;P<0.001)。(2)细胞培养上清液ELISA结果显示:模型组细胞培养液中IL-1β水平较正常组而言明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。LPS+NLRP3敲除组细胞培养上清液IL-1β水平明显低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.001);逍遥散含药血清低、中、高剂量组细胞培养上清液IL-1β水平均低于模型组,按照低中高逐渐降低,其中中剂量含药血清与高剂量含药血清效果最为明显,差异具有统计学意义(P<0.001)。(3)细胞HE染色结果显示:LPS模型组细胞出现明显的胞浆量多,胞体破烂,结构模糊,胞核溶解、固缩的现象。逍遥散含药血清给药组则见不同程度的改善。(4)各组细胞NLRP3、ASC、CASPASE-1蛋白表达结果显示:模型组细胞NLRP3蛋白的表达升高,与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散含药血清组与NLRP3敲除组NLRP3蛋白的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.001;P<0.001)。模型组细胞ASC蛋白的表达升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散含药血清组与NLRP3敲除组ASC蛋白的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.001;P<0.001)。模型组细胞CASPASE-1蛋白的表达升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。逍遥散含药血清组与NLRP3敲除组CASPASE-1蛋白的表达则显著低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.001;P<0.001)。结论:(1)逍遥散可以改善抗生素氨苄西林诱导的肠道菌群失调小鼠的抑郁样行为以及焦虑样行为。(2)抗生素氨苄西林诱导的肠道菌群失调小鼠抑郁样行为与肠道菌群失衡,菌群代谢物内毒素增多有关。(3)菌群代谢物内毒素增多可以诱导NLRP3/ASC/CASPASE-1通路过度激活,释放大量的细胞炎性因子IL-1β。(4)逍遥散改善小鼠行为学异常的机制可能是与其调节肠道菌群失衡,减少内毒素损伤、抑制NLRP3/ASC/CASPASE-1通路、减少细胞炎性因子IL-1β释放有关。