论文部分内容阅读
黄绿蜜环菌是著名的食药兼用菌，黄绿蜜环菌不仅有抗癌之功效，还有延缓衰老、延年益寿、护肤、美容等效果，同时由于它的铁、磷的含量很高，使它成为理想的补血疗养的保健食品和能量代谢、增强肌肤抵抗力、防病的功能性食品。为进一步明确黄绿蜜环菌的药用活性，本文对黄绿蜜环菌多糖（FLP）中β-葡聚糖和甘露寡糖两种主要免疫相关活性成分进行含量检测；进一步对黄绿蜜环菌多糖，醇提物及其各萃取组分进行了对人乳腺癌MCF-7细胞系和人卵巢癌SKOV3细胞系细胞活性的影响进行研究，筛选对影响肿瘤细胞活性的有效成分及最高抑制浓度；进一步建立荷瘤H22小鼠模型，研究了FLP对荷瘤H22小鼠的抗肿瘤作用及其调节小鼠机体血清中四种细胞因子C-反应蛋白（CRP），干扰素-γ（INF-γ），肿瘤坏死因子（TNF-α），白细胞介素（IL-6）水平的功能，探讨FLP对荷瘤机体抗肿瘤作用及免疫相关细胞因子水平的调节；最后研究FLP对调节正常小鼠免疫功能的作用，检测FLP对正常小鼠血清中四种细胞因子CRP，INF-γ，TNF-α，IL-6水平的调节作用，并从分子的角度，用荧光定量PCR方法研究FLP对小鼠肠道样品中调控免疫受体的基因表达量的影响。实验结果如下：1、采用高效液相色谱方法(HPLC)，检测黄绿蜜环菌多糖中β-葡聚糖和甘露寡糖两种主要免疫相关活性成分含量，测得FLP样品中β-葡聚糖和甘露寡糖含量分别为20.1%和5.7%，为实验研究黄绿蜜环菌多糖抗肿瘤作用及免疫调节功能提供实验依据，所以，进一步实验，探讨黄绿蜜环菌多糖及部分成分对体外影响肿瘤细胞活性的影响。2、采用MTT法，研究从黄绿蜜环菌子实体提取出的多糖，95%乙醇提取物，75%乙醇提取物，大孔树脂水提物（水层），石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物对乳腺癌MCF-7细胞和卵巢癌SKOV3细胞的抑制率进行了筛选。实验结果显示，黄绿蜜环菌各活性成分对MCF-7的抑制细胞增殖作用从强到弱依次为黄绿蜜环菌乙酸乙酯层（34.54%）、石油醚层（32.21%）、75%乙醇提取物（27.06%）、多糖（26.03%）、95%乙醇提取物（23.71%），正丁醇层（20.10%）；与之相对应的浓度分别依次为黄绿蜜环菌乙酸乙酯层（100μg/mL）、石油醚层（100μg/mL）、75%乙醇提取物（100μg/mL）、多糖（200μg/mL）、95%乙醇提取物（50μg/mL）、正丁醇层（50μg/mL）；黄绿蜜环菌各活性成分对SKOV3的抑制细胞增殖作用从强到弱依次为黄绿蜜环菌乙酸乙酯层（60.80%）、石油醚层（51.64%）、75%乙醇提取物（42.96%）、95%乙醇提取物（40.85%）、多糖（35.45%），正丁醇层（30.52%）；最适浓度分别依次为黄绿蜜环菌乙酸乙酯层（400μg/mL）、石油醚层（400μg/mL）、75%乙醇提取物（100μg/mL）、95%乙醇提取物（200μg/mL）、多糖（100μg/mL）、正丁醇层（200μg/mL）。实验结果表明，FLP对肿瘤细胞具有一定的抑制作用，但抑制率不及石油醚层和乙酸乙酯层萃取物，是由于多糖对肿瘤的治疗作用主要不是通过直接杀死肿瘤细胞完成，而是通过增强机体的免疫防御系统，激活具有杀伤肿瘤细胞功能的T淋巴细胞，NK细胞，达到抗肿瘤的作用，故进一步对FLP调节机体内抗肿瘤作用进行研究。3、建立荷瘤H22小鼠模型，研究FLP对荷瘤H22小鼠的抗肿瘤作用，及其调节小鼠机体血清中分泌四种细胞因子CRP，INF-γ，TNF-α和IL-6水平的作用，通过统计分析荷瘤小鼠肿瘤重量，免疫器官指数和相关细胞因子含量的变化，探讨其可能的抗肿瘤作用机制。实验结果显示，各实验组的抑瘤率由高到低的顺序为：阳性药组(CTX)>黄绿蜜环菌多糖中剂量组（FLP-M）>黄绿蜜环菌多糖高剂量组（FLP-H）>黄绿蜜环菌多糖低剂量组（FLP-L）>阴性对照组；FLP-H、FLP-M和FLP-L各剂量组均呈现不同程度的抑瘤作用且能够使体重和免疫器官指数升高，而阳性药组，由于阳性药环磷酰胺（CTX）环磷酰胺是一种烷化剂类抗肿瘤药，在较高剂量下对机体免疫力起着一定程度的抑制作用，所以造成CTX组小鼠的免疫器官呈现不同程度的萎缩；FLP高中低剂量组可不同程度的上调四种细胞因子CRP，INF-γ，TNF-α和IL-6的含量，表明FLP通过增强机体免疫功能，上调四种细胞因子水平，调控机体免疫机制达到抗肿瘤作用，故进一步从分子角度，选取FLP-M剂量组（抑瘤率最高）进行实验提取四种免疫相关基因受体，测定其表达水平，研究FLP对机体抗肿瘤免疫调节作用的机制，进一步对正常机体免疫功能进行研究。4、从分子的角度，研究FLP对调节正常小鼠免疫功能的作用。本实验将黄绿蜜环菌多糖以保健品的形式饲养小鼠，通过实验，以免疫器官指数，血清中四种细胞因子CRP，INF-γ，TNF-α，IL-6的含量，肠道中调控免疫作用基因受体TNF-α，CRP，IL-6及IL-8R的表达量为指标，对调节正常健康小鼠免疫功能进行研究，探讨其提高免疫功能的作用机制。实验结果显示，与空白组相比，FLP可显著提高小鼠体重和免疫器官指数；使INF-γ，TNF-α，IL-6的浓度升高，下调血清中CRP的水平；使调控小鼠机体免疫作用的基因TNF-α，IL-6及IL-8R表达量呈现不同程度的增高，而下调CRP的表达量。与空白对照组对比，FLP组呈现显著性差异（P<0.05）。实验结果表明，FLP能够调控与免疫相关基因的表达水平，调节CRP，INF-γ，TNF-α，IL-6分泌水平，从而达到调节对机体的免疫调节作用。