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引言血管内皮是介于血液和血管腔之间的单层细胞,具有生物屏障的功能,对内环境稳态的维系发挥着重要作用。内皮细胞的功能障碍是多种心血管疾病的早期病理基础和始动环节。线粒体作为氧化应激损伤的主要靶点之一,在受到活性氧(Reactive oxygen species,ROS)损伤后不仅会导致内皮细胞能量生成及利用障碍,还会参与到ROS产生与释放的恶性循环,由此导致内皮细胞功能障碍甚至细胞凋亡及死亡。ROS引发的氧化应激损伤与高血压、冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗死后缺血再灌注损伤等心血管疾病的发生发展密切相关。因此寻找有效的抗氧化剂以减轻或逆转内皮细胞的氧化应激损伤,对治疗ROS介导的心血管疾病具有重要的临床意义。传统中药黄芪具有保护心功能、抗炎、抗衰老、降血糖、利尿、减轻疲劳等功效。黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是黄芪的主要有效成分之一,具有免疫调节、促进细胞增殖、舒张血管、清除氧自由基、减轻缺血再灌注损伤及调节细胞凋亡等作用。近年研究显示AS-Ⅳ具备抗氧化应激损伤以保护心血管系统的作用。本实验室前期研究发现AS-Ⅳ可保护血管紧张素Ⅱ所致大鼠血管平滑肌细胞线粒体损伤,同时促进小鼠心肌梗死后的血管再生。而AS-Ⅳ是否能直接拮抗氧化应激损伤以改善内皮细胞功能,尚无相关文献报道。目的研究AS-Ⅳ对过氧化氢引起人主动脉内皮细胞氧化应激损伤是否具有改善作用及其机制。方法1.人主动脉内皮细胞(Human aortic endothelial cells,HAECs)的培养实验所用的HAECs为江苏省人民医院心内科保存细胞株,经复苏、培养传代,鉴定后使用。用于本实验的细胞均为第三代至第五代HAECs。2.过氧化氢(H2O2)损伤浓度的选择将不同浓度(100、200、300、400、500、600、700、800μmol/L)H2O2与 HAECs共同孵育 12h,确定适宜的H2O2浓度作为后期HAECs损伤实验的浓度。3.AS-Ⅳ工作浓度的确定将AS-Ⅳ溶解于二甲基亚砜(DMSO)中作为AS-Ⅳ储备液,在HAECs 中分别加入(6.25、12.5、25、50、100、150μg/ml)浓度的AS-Ⅳ,24h后观察各浓度AS-Ⅳ对细胞活力的影响。以0.1%体积分数DMSO单独干预HAECs,24h后观察细胞活力。4.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs细胞活力的影响400μmol/LH2O2损伤 HAECs 12h 后分别加入 12.5、25、50、100μg/ml 的AS-Ⅳ,24h后观察各浓度AS-Ⅳ对细胞活力的影响,确定适宜的AS-Ⅳ工作浓度。5.实验分组:1)对照组:HAECs培养36h;2)H2O2损伤组:400μmol/L H2O2培养 36h;3)AS-Ⅳ 治疗组:400μmol/LH2O2培养 12h 后,加入50μg/ml AS-Ⅳ 干预 24h。6.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs体外血管生成的作用Matrigel胶铺板后植入各组细胞,观察体外血管生成情况。7.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs细胞迁移能力的作用划痕试验观察各组细胞的迁移情况。8.AS-Ⅳ对H2O2引起的HAECs氧化应激损伤的作用1)比色法检测各组HAECs细胞内丙二醛(MDA)含量;2)比色法检测各组HAECs内ROS生成酶NADPH氧化酶(NOX)及黄嘌呤氧化酶(XOD)活性;3)定量检测各组HAECs内ROS清除酶超氧化物歧化酶(SOD)活性。9.AS-Ⅳ对H2O2引起的HAECs线粒体功能损伤的作用1)比色法检测各组HAECs线粒体内ROS清除酶Mn-SOD活性。2)应用MitoSOXTM线粒体内ROS指示剂标记HAECs线粒体内ROS,共聚焦显微镜下观察HAECs线粒体内ROS含量;3)应用JC-1染料孵育各组细胞,共聚焦显微镜下观察HAECs线粒体膜电位。结果1.不同浓度H2O2对HAECs的损伤作用:超过200μmol/L以上H2O2可造成HAECs活力明显下降,400μmol/L浓度H2O2出现损伤平台。后续实验采用400μmol/L的H2O2作为HAECs的工作浓度。2.AS-Ⅳ对HAECs细胞活力的影响:浓度≤50μg/ml的AS-Ⅳ、0.1%DMSO对HAECs活性无明显影响。后续实验将50μg/ml AS-Ⅳ作为HAECs的工作浓度。3.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs细胞活力的影响:与对照组相比,H2O2可显著降低细胞活力(64.3%vs 100%),AS-Ⅳ可显著提升H2O2损伤后HAECs的细胞活力(79.5%vs 64.3%)。4.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs体外血管生成能力的影响:与对照组相比,H2O2显著降低HAECs体外血管生成环分支点数(18 vs 40),AS-Ⅳ治疗与H2O2损伤后相比,体外血管生成能力出现明显提高(26 vs 18)。5.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs迁移的影响:与对照组相比,H2O2组内皮细胞划痕后,细胞迁移能力出现明显降低(1.9%vs 100%),AS-Ⅳ治疗后HAECs向划痕区域迁移能力显著提升(60.5%vs 1.9%)(p<0.05)。6.AS-Ⅳ对H2O2损伤后HAECs氧化应激的改善作用:与对照组相比,H2O2显著增加了 HAECs内MDA含量,达5倍以上(p<0.05),AS-Ⅳ治疗后,胞内MDA含量降低为H2O2组的60%(p<0.05)。H2O2损伤后,HAECs的NOX与XOD活性显著升高(270%vs 100%,203%vs 100%)(p<0.05),经 AS-Ⅳ 治疗后,NOX活性仅为H2O2组的60%,XOD活性约为H2O2组的77%。H2O2损伤后HAECs内总SOD活性显著下降(43.9%vs 100%),AS-Ⅳ治疗后,与H2O2组相比,HAECs内总SOD活性显著增强(67.3%vs 43.9%)。7.AS-Ⅳ对H2O2诱导的HAECs线粒体功能损伤的修复作用:与对照组相比,H2O2损伤后HAECs线粒体内Mn-SOD活性显著下降(53.5%vs 100%),AS-Ⅳ 治疗后,与 H2O2 组相比,HAECs 线粒体内 Mn-SOD活性显著增强(76.5%vs 53.5%)。与对照组相比,H2O2干预HAECs 36h后线粒体ROS含量增高2.72倍(p<0.05),而AS-Ⅳ治疗组与H2O2组相比,HAECs线粒体ROS明显降低(164%vs 272%)(p<0.05)。与对照组相比,H2O2 组 HAECs 线粒体膜电位(△Ψm)明显降低(0.78 vs 0.44)(p<0.05),AS-Ⅳ治疗后,HAECs线粒体膜电位(△Ψm)显著提升(0.57 vs 0.78)(p<0.05)。结论H2O2可引起HAECs功能损伤,AS-Ⅳ干预后,可明显提高HAECs的细胞活力、体外血管生成及迁移能力,改善H2O2引起的HAECs氧化应激损伤,使HAECs内ROS含量及MDA下降,线粒体膜电位增高。AS-Ⅳ可改善H2O2所致HAECs损伤,降低细胞内ROS生成,增强细胞及线粒体ROS清除能力是其机制之一。