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新城疫(Newcastle disease,ND)是对畜禽危害最大的A类传染病之一,它是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种具有高度传染性的禽类急性传染病。F蛋白是NDV主要的免疫保护性抗原和致病相关性抗原,在机体产生保护性抗体和免疫应答过程中有重要作用,已成为人们研究ND疫苗的首选抗原。单克隆抗体技术的愈加广泛的应用使得F蛋白的抗原优势表位逐渐被认识。针对抗原变异日趋复杂的NDV来说,通过选择最佳和最具免疫保护率的表位以解决不同病毒株间因抗原差异引起的免疫失败问题已显得至关重要。近年来还发现,白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)作为一种有效的免疫刺激因子可使DNA疫苗的免疫效应得到调节和增强。但是鸡IL-2的研究十分滞后,本研究拟进一步探讨鸡重组IL-2对NDV表位疫苗的免疫调节作用。本课题以免疫刺激细胞因子鸡IL-2、NDV F抗原以及利用生物信息学软件综合预测的F抗原表位F_s和F_y为目的基因,分别克隆至具有CMV启动子和VSVGED、WPRE、ITRs调控元件的假型杆状病毒pLMI转移载体中,通过Bac-to-Bac系统获得重组Bacmid DNA,将其转染Sf9昆虫细胞来获得重组杆状病毒。利用获得的重组杆状病毒直接作为疫苗进行鸡体免疫,使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体与较强的细胞免疫应答,筛选出免疫效果较好的主要保护性抗原表位基因,为进一步研究NDV F蛋白的抗原表位奠定基础;同时利用BV-LMI-IL-2表达的IL-2蛋白作为免疫刺激因子,比较分析对不同抗原表位疫苗免疫效果的影响,为研究增强NDV保护性抗原蛋白免疫效果奠定基础。本研究成功构建了重组杆状病毒BV-LMI-F、BV-LMI-F_s、BV-LMI-F_y和BV-LMI-IL-2,用获得的重组杆状病毒侵染鸡胚成纤维细胞,通过SDS-PAGE和Western blotting可检测到抗原表位F_s与F_y蛋白、鸡IL-2蛋白以及F蛋白均已成功表达。间接免疫荧光检测结果表明:VSV-GED蛋白可在Sf9昆虫细胞中成功表达,并展示在了杆状病毒表面使杆状病毒的转导效率得到增强。F的抗原多肽F_s、F_y两个重组杆状病毒及F重组杆状病毒与鸡IL-2重组杆状病毒以不同组合分别免疫SPF鸡,并设置商品化疫苗、PBS对照组和空载体对照组。免疫试验结果显示:重组杆状疫苗组免疫保护率最高达100%,F_s和F_y免疫组免疫保护率分别达到50%和62.5%,而对照组免疫保护率仅达到12.5%,差异显著(P<0.05)。而F_s+IL-2免疫组和F_y+IL-2免疫组免疫保护率分别达到了62.5%和75%,说明IL-2可以作为免疫刺激因子来提高疫苗的免疫效果。利用ELISA试剂盒检测不同免疫天数鸡血清中IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ、CD4~+分子和CD8~+分子含量,同时检测免疫血清中的中和抗体水平和鸡外周血淋巴细胞刺激指数来综合比较不同重组杆状病毒疫苗的免疫效果。抗原F、F_s和F_y重组杆状病毒疫苗以及与鸡IL-2共同免疫组F+IL-2、F_s+IL-2和F_y+IL-2重组杆状病毒疫苗血清抗体水平显著高于空载体组和PBS对照组(P<0.05),在42天时,F+IL-2试验组抗体水平达到最高,分别是(1:1452),与F试验组抗体水平(1:1247)差异显著(P<0.05);在42天时,IL-2、IL-4、CD4~+分子和CD8~+分子含量达到峰值,分别达到73.46 pg/mL、136.33pg/mL、79.83 ng/mL及45.62 ng/mL。IFN-γ与血清IgG水平在56天分别达到峰值68.52 pg/mL与1.846,表明重组杆状病毒疫苗可以刺激鸡体使其产生较强的细胞免疫与体液免疫应答。综上,本研究成功构建了具有F、F_s、F_y和IL-2抗原基因的重组杆状病毒,并可在鸡胚成纤维细胞中高效的表达,构建的重组杆状病毒具有较高的转导效率,并且在机体内的表达时间比商业化疫苗Lasota有明显提高;在与IL-2联合免疫时,机体产生了更强的免疫效果,说明了IL-2可作为免疫佐剂使用;对于变异的病毒毒株,可根据变异病毒株的抗原基因快速构建重组杆状病毒疫苗,比商业化疫苗Lasota具有更强的适用性。本研究将为筛选确定更有效的NDV保护性抗原基因研究奠定基础,同时表明鸡IL-2具有良好的佐剂活性,是一个有潜在应用前景的分子免疫佐剂,为新型新城疫疫苗的研制开创了新的思路。