【摘 要】
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目的:烟雾吸入性急性肺损伤是造成烧伤患者死亡的主要原因之一,亟需发现新的潜在治疗靶点。为此,我们通过建立烟雾吸入性急性肺损伤小鼠模型和细胞模型,利用生物信息分析技术及分子生物学手段筛选出并验证14-3-3σ在烟雾吸入性急性肺损伤中的作用及其机制。方法:1、制备烟雾吸入性肺损伤小鼠模型:60只Balb/c小鼠按照5ml/kg体重腹腔注射4%无菌戊巴比妥麻醉,对照组25只呼吸正常空气,烟雾吸入性损伤组
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目的:烟雾吸入性急性肺损伤是造成烧伤患者死亡的主要原因之一,亟需发现新的潜在治疗靶点。为此,我们通过建立烟雾吸入性急性肺损伤小鼠模型和细胞模型,利用生物信息分析技术及分子生物学手段筛选出并验证14-3-3σ在烟雾吸入性急性肺损伤中的作用及其机制。方法:1、制备烟雾吸入性肺损伤小鼠模型:60只Balb/c小鼠按照5ml/kg体重腹腔注射4%无菌戊巴比妥麻醉,对照组25只呼吸正常空气,烟雾吸入性损伤组35只吸入烟雾。2、小鼠肺大体:对照组、损伤后0小时组各取6只小鼠,腹腔注射4%戊巴比妥,放血处死,取出完整的肺脏组织拍摄肺大体图片。3、小鼠肺组织病理检测:对照组、损伤后24小时组各取6只小鼠,腹腔注射4%戊巴比妥,放血处死,取左上叶肺组织放入4%多聚甲醛固定,用于病理切片HE染色。4、小鼠肺组织RNA-seq检测:对照组、损伤后4小时组、损伤后24小时组各取9只小鼠,腹腔注射4%戊巴比妥后放血处死,完整取出肺组织放入液氮速冻,用干冰运送至测序公司进行RNA-seq（测序样本分组:每组9只小鼠按随机数字表法分成3份,每份含3只小鼠肺组织,共9份样本）。5、建立烟雾吸入性损伤细胞模型:培养人正常肺上皮细胞BEAS-2B,收集烟雾并溶解于DMEM培养基,用于模拟细胞烟雾环境。6、检测14-3-3σ对NF-κB信号通路相关基因蛋白表达的影响:实验分组:空白对照组、空载质粒对照组、pCMV6-14-3-3σ组、pCMV6-14-3-3σ+烟雾培养基组、烟雾培养基组。根据需要在不同时间点采集细胞,并通过Western blot检测IκB、P-IκB、NF-κB的表达。7、检测14-3-3σ对NF-κB入核的影响:激光共聚焦技术检测NF-κB的易位。8、检测14-3-3σ对炎症因子表达的影响:实验分组:空白对照组、空载质粒对照组、pCMV6-14-3-3σ组、pCMV6-14-3-3σ+烟雾培养基组、烟雾培养基组。在不同时间点收集细胞和上清液,并通过实时定量PCR和酶联免疫吸附法检测TNF-α和IL-1βmRNA和蛋白的表达。结果:1、烟雾吸入性损伤小鼠肺大体形态:对照组肺表面光滑,颜色呈粉白色,烟雾吸入性损伤小鼠肺脏表面充血、饱满,呈深粉色。2、烟雾吸入性损伤小鼠肺组织病理:对照组肺腔未见明显渗出、结构完整,损伤组肺泡腔有炎性渗出,部分肺泡呈扩张或者融合。3、转录组测序结果:测序样本质量合格。吸入烟雾能影响小鼠肺组织的基因表达谱。通过对转录组结果的分析,发现对照组与吸入烟雾后4小时的差异转录基因有449个,其中326个基因上调,123个基因下调;对照组与吸入烟雾后24小时相比,差异转录基因有240个,其中200个基因上调,40个基因下调。4、Western blotting检测14-3-3σ对IκB、P-IκB、NF-κB蛋白表达的影响:SM组细胞核内NF-κB表达增加,14-3-3σ的过表达抑制NF-κB向细胞核内位移5、激光共聚焦技术检测14-3-3σ对NF-κB核易位的影响:SM组NF-κB向细胞核内位移增多,核内NF-κB表达量增高,过表达14-3-3σ可抑制NF-κB向核内的位移。6、实时荧光定量PCR法检测14-3-3σ对炎症因子TNF-α、IL-1β的影响:SM组细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达量上调,过表达14-3-3σ可减少TNF-α、IL-1βmRNA的表达。7、酶联免疫吸附法检测14-3-3σ对TNF-α和IL-1β的影响:SM组上清液中TNF-α和IL-1β浓度升高,14-3-3σ过表达可减少TNF-α和IL-1β的分泌。结论:烟雾诱导BEAS-2B细胞IκB磷酸化,NF-κB解离并向核内位移增多,导致相关炎症因子表达增多,引起炎症反应,而过表达14-3-3σ可抑制IκB的磷酸化,通过减少NF-κB向核内位移,减少炎症因子产生,降低炎症反应。
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