目的 建立EvaGreen qPCR检测牛腺病毒3型（bovine adenovirus 3, BAV3）的方法，用于牛血清等牛源材料的检测。方法 依据GenBank公布的BAV3标准毒株WBR-1全基因序列，基于E2B区域高度保守序列设计引物，提取并制备DNA标准品，建立EvaGreen qPCR检测BAV3的方法，并对该方法的特异性、灵敏度及精密度进行验证。最后利用该方法检测牛血清中的BAV3,并与细胞培养法及荧光抗体检测对比，以验证该方法的适用性。结果 建立的EvaGreen qPCR检测BAV3的方法标准曲线R~2＞0.99,扩增效率处于90%～110%,可检测范围为0.2×10~0～0.2×107 copies/μL。实验内Ct值的CV＜2.2%,在不同实验间Ct值的CV＜1.8%。设计的BAV3引物与牛腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）、副流感病毒3型（parainfluenza virus 3, PI3）、呼肠孤病毒（reovirus, REO）、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）、狂犬病毒（rabies virus, RV）、羊轮状病毒（Lanzhou lamb rotavirus, LLR）基因组均无交叉反应，特异性良好。采用EvaGreen qPCR对198份新生牛血清进行BAV3检测，阳性检出率为10.1%,检出率高于细胞培养法及荧光抗体检测。结论 成功建立了EvaGreen qPCR检测BAV3的方法，该方法快速、灵敏、特异、易于标准化，可用于牛血清中BAV3的检测。