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[摘要] 目的 探讨哮喘患儿单个核细胞FOXP3 mRNA表达应用实时荧光定量RT-PCR检测的临床意义。 方法 选取来本院就诊的29例哮喘患儿和24例正常健康儿童作为对照，对两组病例应用流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，并鉴定PCR产物特异性。 结果 哮喘患儿组CD4+CD25+Treg检测结果为（8.26±2.04）%，显著低于对照组（12.71±2.53）%，差异有统计学意义（P<0.01）。哮喘患儿组FOXP3/β-actin的2-△Ct值为（0.49±0.15），对照组为（0.62±0.18），两者比较，有显著性差异（P<0.05）。外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA表达与淋巴细胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相关（r=0.679，P<0.05）。经融解曲线分析显示FOXP3和β-actin均仅有单一扩增产物。 结论 对于哮喘患儿单个核细胞FOXP3 mRNA表达水平应用实时荧光定量RT-PCR检测，方法简便，结果稳定、可靠。
[关键词] 哮喘；单个核细胞；FOXP3 mRNA；CD4+CD25+Treg；实时荧光定量RT-PCR
[中图分类号] R446.43 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）08-125-02
CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是一群具有免疫抑制功能的T细胞，在CD4+CD25+Treg上可见FOXP3特异性高水平表达，它具有反映CD4+CD25+Treg的活性水平[1-3]。研究表明，CD4+CD25+Treg与哮喘的发生和发展有着密切关系，CD4+CD25+Treg能够对Th2细胞的活化起到抑制作用[4]。本研究探讨了哮喘患儿单个核细胞FOXP3 mRNA表达应用实时荧光定量RT-PCR检测的临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取于本院就诊的29例经哮喘诊断标准[5]确诊的哮喘患儿，其中男19例，女10例；年龄3～14岁，平均（6±2）岁；哮喘病程2～8年。并选取24例正常无过敏性疾病史的健康儿童作为对照组，其中男15例，女9例；年龄3～13岁，平均（6.0±1.5）岁。两组性别、年龄等一般资料经比较无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
采集静脉血4 mL，分别装入两支EDTA抗凝试管中，各2 mL。应用流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性，包括引物设计、淋巴细胞分离、逆转录、荧光定量PCR反应体系、扩增产物电泳分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS15.0统计学软件，计量资料采用（）表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 荧光定量方法学评价
2.1.1 特异性 FOXP3和β-actin扩增产物经电泳后出现约176bp和205bp两条特异性条带，经融解曲线分析显示FOXP3和β-actin均只有一个尖峰，分别是82.4℃解链温度和87.8℃解链温度，说明FOXP3和β-actin分别仅有一扩增产物。
2.1.2 稀释逆转录产物 10倍稀释逆转录产物cDNA，0.637/反应为最低检测限，0.637～0.796/反应为线性范围，相当于Ct值18-37跨度，r=0.98。
2.1.3 精密度 重复测定Ct值为21和Ct值为35的2份标本，结果经对数处理后其批内CV值为1.6%～2.8%，批间CV值为2.5%～6.7%。见图1。
图1 精密度测定
2.2 两组CD4+CD25+Treg结果比较
哮喘患儿组CD4+CD25+Treg检测结果为（8.26±2.04）%，对照组为（12.71±2.53）%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3 两组FOXP3/β-actin的2-△Ct值比较
哮喘患儿组FOXP3/β-actin的2-△Ct值为0.49±0.15，对照组为0.62±0.18，两者比较，有显著性差异（P<0.05）。
2.4 FOXP3 mRNA与CD4+CD25+Treg的相关性
外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA表达与淋巴细胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相关（r=0.679，P<0.05）。
3 讨论
与普通PCR比较，SYBR Green I实时定量PCR具有特异、快速、敏感特点。SYBR Green I实时定量PCR无需合成特异探针，故而使用方便，但非特异产物可干扰靶基因的产物定量。作为一种荧光染料，SYBR Green I能与双链DNA非特异性结合并发出荧光，其与游离状态荧光强度相比强百余倍，因此可以通过检测荧光强度来检测出双链DNA数量。但检测荧光强度也会出现假阳性结果，这是因为非特异性扩增或引物二聚体也可以产生荧光，从而干扰检测结果。鉴于假阳性结果的出现，本研究为了区别是由PCR产物产生的荧光信号还是本底造成的荧光信号，在定量反应结束后特别进行了融解曲线分析。由于在融解曲线上PCR产物是单一峰，Tm值也较非目的产物要高[9]，因此可以通过分析融解曲线来证实扩增产物的特异性。本研究结果显示，特异性FOXP3和β-actin扩增产物经融解曲线分析显示FOXP3和β-actin均只有一个尖峰，分别是82.4℃解链温度和87.8℃解链温度，说明其扩增的特异性。
研究报道，儿童支气管哮喘发病机制中免疫功能紊乱起着不容忽视的作用，目前关注的焦点在于淋巴细胞亚群的比例和功能紊乱。哮喘发病与免疫耐受的破坏和Th1/Th2功能失调有关。研究认为，CD4+CD25+Treg水平和功能的正常维持对良好的免疫耐受状态建立有很好的作用，从而对哮喘的发生和发展起到阻止作用[6]。FOXP3作为一种特殊的转录因子，在CD4+CD25+Treg上特异性高水平表达，它可以反映CD4+CD25+Treg的活性水平[7-8]。本研究结果显示，在外周血CD4+CD25+Treg的比例及FOXP3 mRNA的表达上哮喘患儿组较对照组低，表明因CD4+CD25+Treg数量不足，以致免疫抑制功能降低，效应性CD4+T细胞活化，特别是Th2细胞，大量致炎因子产生，从而使哮喘发作或持续。因此我们猜测，CD4+CD25+Treg与哮喘的发生和发展关系密切，对CD4+CD25+Treg的检测将有助于哮喘患儿的诊断和治疗。本研究结果还显示，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势，存在一定的相关性。因此，这种从外周血单个核细胞中检测FOXP3 mRNA的方法简单，重复性好，敏感性和特异性较高，值得推广。
[参考文献]
[1] Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs thedevelopment and function of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4（1）：330-336.
[2] Khattri R，Cox T，Yasayko SA，et al.An essential role forscurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells[J].Nat Immunol，2003，4（2）：337-342.
[3] Mochizuki H，Shigeta M，Morikawa A.Develepment of bron-chial hyperresponsiveness during childhood[J].J Asthma，2001，38（1）：1-21.
[4] 中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘防治常规（试行）[J].中华儿科杂志，2004，42（1）：100-106.
[5] Seroogy CM，Gern JE.The role of T regulatory cells in asthma[J].Allergy Clin Immunol，2005，116（2）：996-999.
[6] Picca CC，Caton AJ.The role of self-peptides in the develop-ment of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Curr OpinImmunol，2005，17（2）：131-136.
[7] Yi H，Zhen Y，Jiang L，et al.The phenotypic characterizationof naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells[J].Cell Mol Immunol，2006，3（1）：189-195.
（收稿日期：2013-01-08）
[关键词] 哮喘；单个核细胞；FOXP3 mRNA；CD4+CD25+Treg；实时荧光定量RT-PCR
[中图分类号] R446.43 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）08-125-02
CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是一群具有免疫抑制功能的T细胞，在CD4+CD25+Treg上可见FOXP3特异性高水平表达，它具有反映CD4+CD25+Treg的活性水平[1-3]。研究表明，CD4+CD25+Treg与哮喘的发生和发展有着密切关系，CD4+CD25+Treg能够对Th2细胞的活化起到抑制作用[4]。本研究探讨了哮喘患儿单个核细胞FOXP3 mRNA表达应用实时荧光定量RT-PCR检测的临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取于本院就诊的29例经哮喘诊断标准[5]确诊的哮喘患儿，其中男19例，女10例；年龄3～14岁，平均（6±2）岁；哮喘病程2～8年。并选取24例正常无过敏性疾病史的健康儿童作为对照组，其中男15例，女9例；年龄3～13岁，平均（6.0±1.5）岁。两组性别、年龄等一般资料经比较无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
采集静脉血4 mL，分别装入两支EDTA抗凝试管中，各2 mL。应用流式细胞仪检测外周血单个核细胞（PBMCs）中CD4+CD25+Treg的比例，采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性，包括引物设计、淋巴细胞分离、逆转录、荧光定量PCR反应体系、扩增产物电泳分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS15.0统计学软件，计量资料采用（）表示，采用t检验，计数资料采用x2检验，P<0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 荧光定量方法学评价
2.1.1 特异性 FOXP3和β-actin扩增产物经电泳后出现约176bp和205bp两条特异性条带，经融解曲线分析显示FOXP3和β-actin均只有一个尖峰，分别是82.4℃解链温度和87.8℃解链温度，说明FOXP3和β-actin分别仅有一扩增产物。
2.1.2 稀释逆转录产物 10倍稀释逆转录产物cDNA，0.637/反应为最低检测限，0.637～0.796/反应为线性范围，相当于Ct值18-37跨度，r=0.98。
2.1.3 精密度 重复测定Ct值为21和Ct值为35的2份标本，结果经对数处理后其批内CV值为1.6%～2.8%，批间CV值为2.5%～6.7%。见图1。
图1 精密度测定
2.2 两组CD4+CD25+Treg结果比较
哮喘患儿组CD4+CD25+Treg检测结果为（8.26±2.04）%，对照组为（12.71±2.53）%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3 两组FOXP3/β-actin的2-△Ct值比较
哮喘患儿组FOXP3/β-actin的2-△Ct值为0.49±0.15，对照组为0.62±0.18，两者比较，有显著性差异（P<0.05）。
2.4 FOXP3 mRNA与CD4+CD25+Treg的相关性
外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA表达与淋巴细胞中CD4+CD25+Treg比例呈正相关（r=0.679，P<0.05）。
3 讨论
与普通PCR比较，SYBR Green I实时定量PCR具有特异、快速、敏感特点。SYBR Green I实时定量PCR无需合成特异探针，故而使用方便，但非特异产物可干扰靶基因的产物定量。作为一种荧光染料，SYBR Green I能与双链DNA非特异性结合并发出荧光，其与游离状态荧光强度相比强百余倍，因此可以通过检测荧光强度来检测出双链DNA数量。但检测荧光强度也会出现假阳性结果，这是因为非特异性扩增或引物二聚体也可以产生荧光，从而干扰检测结果。鉴于假阳性结果的出现，本研究为了区别是由PCR产物产生的荧光信号还是本底造成的荧光信号，在定量反应结束后特别进行了融解曲线分析。由于在融解曲线上PCR产物是单一峰，Tm值也较非目的产物要高[9]，因此可以通过分析融解曲线来证实扩增产物的特异性。本研究结果显示，特异性FOXP3和β-actin扩增产物经融解曲线分析显示FOXP3和β-actin均只有一个尖峰，分别是82.4℃解链温度和87.8℃解链温度，说明其扩增的特异性。
研究报道，儿童支气管哮喘发病机制中免疫功能紊乱起着不容忽视的作用，目前关注的焦点在于淋巴细胞亚群的比例和功能紊乱。哮喘发病与免疫耐受的破坏和Th1/Th2功能失调有关。研究认为，CD4+CD25+Treg水平和功能的正常维持对良好的免疫耐受状态建立有很好的作用，从而对哮喘的发生和发展起到阻止作用[6]。FOXP3作为一种特殊的转录因子，在CD4+CD25+Treg上特异性高水平表达，它可以反映CD4+CD25+Treg的活性水平[7-8]。本研究结果显示，在外周血CD4+CD25+Treg的比例及FOXP3 mRNA的表达上哮喘患儿组较对照组低，表明因CD4+CD25+Treg数量不足，以致免疫抑制功能降低，效应性CD4+T细胞活化，特别是Th2细胞，大量致炎因子产生，从而使哮喘发作或持续。因此我们猜测，CD4+CD25+Treg与哮喘的发生和发展关系密切，对CD4+CD25+Treg的检测将有助于哮喘患儿的诊断和治疗。本研究结果还显示，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势，存在一定的相关性。因此，这种从外周血单个核细胞中检测FOXP3 mRNA的方法简单，重复性好，敏感性和特异性较高，值得推广。
[参考文献]
[1] Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs thedevelopment and function of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4（1）：330-336.
[2] Khattri R，Cox T，Yasayko SA，et al.An essential role forscurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells[J].Nat Immunol，2003，4（2）：337-342.
[3] Mochizuki H，Shigeta M，Morikawa A.Develepment of bron-chial hyperresponsiveness during childhood[J].J Asthma，2001，38（1）：1-21.
[4] 中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘防治常规（试行）[J].中华儿科杂志，2004，42（1）：100-106.
[5] Seroogy CM，Gern JE.The role of T regulatory cells in asthma[J].Allergy Clin Immunol，2005，116（2）：996-999.
[6] Picca CC，Caton AJ.The role of self-peptides in the develop-ment of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Curr OpinImmunol，2005，17（2）：131-136.
[7] Yi H，Zhen Y，Jiang L，et al.The phenotypic characterizationof naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells[J].Cell Mol Immunol，2006，3（1）：189-195.
（收稿日期：2013-01-08）