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摘要：研究草莓体内能够分离培养的微生物的群落组成和结构，对健康草莓稳态菌群的构建和保持具有重要意义。以健康草莓为研究样本，对其根、茎、叶内的真菌和细菌进行分离培养，分别利用真菌rDNA-ITS引物和细菌16S rRNA引物进行PCR扩增，然后基于测序及其生物信息学分析鉴定微生物种类。结果表明，从健康草莓根、茎、叶部获得了真菌1个门4个属中的14株菌株和细菌3个门6个属中的14株菌株，其中细菌内生菌的多样性高于真菌类群;3个器官中根部内生菌的多样性程度最高;芽孢杆菌（Bacillus）和葡萄孢属（Botrytis）是丰度较高的2个内生菌属。本研究初步明确了草莓不同部位可培养内生菌的分布特点和规律，为探索利用这些内生菌以促进草莓健康生长奠定了基础。
关键词：草莓;内生菌;根;茎;叶;多样性;促生作用
中图分类号：S668.401;S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2021）07-0130-05
收稿日期：2020-07-27
基金项目：国家自然科学基金（编号：31671971、31871907）;2016年度江苏高校青蓝工程项目;2018年度扬州大学“高端人才支持计划”（拔尖人才成长计划）。
作者简介：施宁雪（1996—），女，江苏南京人，硕士研究生，主要从事植物真菌病害研究，E-mail：whoilove1996@163.com;
共同第一作者：张 烨（1995—），男，江苏南通人，硕士研究生，主要从事植物真菌病害研究，E-mail：424396702@qq.com。
通信作者：陈孝仁，博士，教授，主要从事植物真菌病害研究。E-mail：xrchen@yzu.edu.cn。
内生微生物（endophytic microorganisms）是植物微生态系统的重要组成部分，是一大类能够在健康植物活组织内生存而不引起明显寄主植物病变的微生物，主要包括细菌、真菌、放线菌和病毒[1-4]。内生微生物一生或在生活史的某个阶段生活于植物活组织内，在长期的进化过程中与寄主植物建立了和谐联合的关系，是植物微生态系统中巨大而宝贵的资源库[5-6]。自20世纪90年代以来，植物内生微生物逐渐成为微生物学研究的热点，对它的认识逐渐深入。首先，内生微生物种类多样，最常见的是细菌、真菌和放线菌，亦被合称为内生菌（endophytes）。已经明确地球上所有科的植物都含有内生真菌[7]。其次，内生微生物不仅可以提高植物抗生物逆境（抗病、抗虫及其他食草动物）和抗非生物逆境能力，还可以帮助植物吸收磷、氮、硫及微量元素[8-9]。此外，内生菌能够降解环境中的有害污染物，具有生物修复能力[6]。
深入了解植物内生微生物，尤其是内生菌的种类、生活史、新陈代谢及其与寄主植物的相互关系，对其在农业上的应用具有重要意义。目前，尚不清楚植物内生菌的具体种类和数量。一般而言，不同地理环境下生长的植物具有的内生菌可能不一样。例如，高纬度地区的植物内生菌种类较少，且多来自子囊菌门;而热带地区植物的内生菌种类则更加丰富[10]。此外，在相似环境下生长的不同植物可能拥有不同的内生菌[11]。随着分子生物学技术的不断发展，利用高通量测序等技术分析微生物的核糖体RNA （rRNA）序列可对植物内生菌进行全面而快速的鉴定[12]，微生物组学（microbiome）也应运而生。尽管如此，這些分子生物学手段未涉及到植物内生菌的分离培养，因此也就无法进行下一步的内生菌开发利用工作。
草莓是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）的多年生草本植物，其果实酸甜可口、营养丰富，是一种具有较高经济价值的水果。目前，针对草莓的微生物组研究主要是围绕草莓根际土壤、果实表面或者叶片表面的微生物类群，针对其内生菌的研究报道很少，不利于草莓内生菌的开发利用[13-20]。开发利用植物内生菌，首要条件就是可以人工分离、培养这些微生物，以进一步分析其生活史、生理生化性状以及与植物的关系。有鉴于此，本试验从健康草莓的根、茎、叶不同部位分离内生真菌和细菌，并利用分子生物学技术进行快速鉴定，分析草莓不同部位内生菌的分布特点和规律，以期为探索利用这些内生菌以促进草莓健康生长奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2017年5月在江苏省扬州市施桥镇扬子村任桥露地草莓园（119°43′7.00′′E，32°31′7.00′′N）采集草莓品种章姬（Akihime）为试材。在无病田选取3处进行“S”形取样，共采集15株草莓，整株挖出，用无菌袋低温保存带回实验室。利用自来水冲洗掉植株根部和表面的土壤和残屑，再用无菌水彻底冲洗植株，晾干待用。
1.2 内生菌的分离
分离健康草莓根、茎、叶部的内生真菌和细菌。叶片取样分3个部位（从叶片边缘切取的约5 mm×5 mm的组织、主叶脉中间段2侧切取的约5 mm×5 mm 的组织、5～8 mm的叶柄中段）。根状茎取样分2个部位：韧皮部和木质部各取5 mm×5 mm的组织。根取样分3个部位进行：表皮、皮层和维管束各取5 mm×5 mm的组织。
1.2.1 内生真菌的分离 植物组织置于0.5%次氯酸钙溶液中消毒0.5～1 min，然后在无菌水中漂洗3次，晾干后置放在含0.5 μL/mL 96%乳酸的PDA平板（马铃薯200 g，葡萄糖16.0～20.0 g，琼脂16.0～20.0 g，蒸馏水1 000 mL）上。平板静置于霉菌培养箱（22±2） ℃内培养3 d，长出的菌丝尖端转入新的PDA平板。利用分生孢子进行菌株纯化，获得的单孢株保存于4 ℃。
1.2.2 内生细菌的分离 将植物组织用0.5%次氯酸钙消毒0.5～1 min，然后用无菌水冲洗3次，将组织块加入无菌水中捣碎制成悬浮液，然后吸取100 μL悬浮液用划线法涂布于NA固体培养基（牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH值7.0，琼脂16.0 g）上，晾干后将培养皿置于30 ℃条件下培养3 d，挑取单菌落进行划线纯化。 1.3 分子生物学鉴定
1.3.1 基因组DNA的提取 在PDA平板表面铺上灭菌的玻璃纸，将真菌菌株接种到玻璃纸上，置于25 ℃培养箱培养3～4 d，再利用金属铲收集玻璃纸上的菌丝。利用杭州爱思进公司基因组DNA试剂盒（AP-MN-MS-GDNA-250）提取菌丝的基因组DNA。
挑取细菌单菌落加入到含有5 mL KB培养液的试管中，30 ℃、200 r/min培养过夜。取1.5 mL菌液离心收集菌体，利用CTAB/NaCl法[21]提取细菌基因组DNA。
1.3.2 PCR扩增 利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列为16S 33F：5′-ATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S 1387R：5′-TATTGGTGTGACGGGGGGTGT-3′。利用真菌rDNA-ITS （internal transcribed spacer，核糖体基因转录间隔区）通用引物进行PCR扩增，引物序列为ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′。
PCR扩增体系：2 μL 1×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol/L Mg2 、100～300 ng DNA、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，无菌水补齐到 20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸 1 min，31个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，通过胶回收、TA载体克隆，送往上海生工生物工程有限公司进行序列测定。
1.3.3 生物信息学分析 序列提交到NCBI数据库，进行BlastN比对，并登录GenBank。将获得的所有序列进行多重比对，再用MEGA7的Neighbor-Joining法构建系统发育树，采用自举法（bootstrap）对系统发育树进行检验，共1 000次循环，以保证系统树的可靠性。
2 结果与分析
2.1 菌株分离结果
本研究從健康草莓根、茎、叶这3个器官的8个部位采样，分成两等份分别进行细菌和真菌的分离，最后共获得14株真菌菌株和14株细菌菌株（表1）。其中，来自叶片的真菌菌株有8株，细菌菌株有5株;来自茎的真菌菌株有1株，细菌菌株有4株;来自根部的真菌和细菌菌株各有5株。菌株数目的不同可能与不同器官分离的部位数量有一定关系。
2.2 属水平上内生菌的多样性
对细菌菌株的16S rDNA、真菌菌株的rDNA-ITS序列进行扩增、克隆与测序，获得了长度分别为1 455～1 519、563～615 bp的片段序列， 提交GenBank进行登记（表1）。基于这些序列在NCBI数据库中的比较，将菌株鉴定到属或者种水平。由表1可知，分离获得的真菌菌株来自真菌界的4个属：葡萄孢属（Botrytis）、枝穗霉属（Clonostachys）、新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）和小不整球壳属（Plectosphaerella）。分离获得的细菌菌株来自原核生物界的6个属：芽孢杆菌属（Bacillus）、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）。细菌的多样性高于真菌。
进一步对分离的菌株进行分析，发现草莓不同部位中可培养内生菌在属水平上呈现出多样性的特点。按照内生菌多样性的丰富度从高到低排列，根部
关键词：草莓;内生菌;根;茎;叶;多样性;促生作用
中图分类号：S668.401;S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2021）07-0130-05
收稿日期：2020-07-27
基金项目：国家自然科学基金（编号：31671971、31871907）;2016年度江苏高校青蓝工程项目;2018年度扬州大学“高端人才支持计划”（拔尖人才成长计划）。
作者简介：施宁雪（1996—），女，江苏南京人，硕士研究生，主要从事植物真菌病害研究，E-mail：whoilove1996@163.com;
共同第一作者：张 烨（1995—），男，江苏南通人，硕士研究生，主要从事植物真菌病害研究，E-mail：424396702@qq.com。
通信作者：陈孝仁，博士，教授，主要从事植物真菌病害研究。E-mail：xrchen@yzu.edu.cn。
内生微生物（endophytic microorganisms）是植物微生态系统的重要组成部分，是一大类能够在健康植物活组织内生存而不引起明显寄主植物病变的微生物，主要包括细菌、真菌、放线菌和病毒[1-4]。内生微生物一生或在生活史的某个阶段生活于植物活组织内，在长期的进化过程中与寄主植物建立了和谐联合的关系，是植物微生态系统中巨大而宝贵的资源库[5-6]。自20世纪90年代以来，植物内生微生物逐渐成为微生物学研究的热点，对它的认识逐渐深入。首先，内生微生物种类多样，最常见的是细菌、真菌和放线菌，亦被合称为内生菌（endophytes）。已经明确地球上所有科的植物都含有内生真菌[7]。其次，内生微生物不仅可以提高植物抗生物逆境（抗病、抗虫及其他食草动物）和抗非生物逆境能力，还可以帮助植物吸收磷、氮、硫及微量元素[8-9]。此外，内生菌能够降解环境中的有害污染物，具有生物修复能力[6]。
深入了解植物内生微生物，尤其是内生菌的种类、生活史、新陈代谢及其与寄主植物的相互关系，对其在农业上的应用具有重要意义。目前，尚不清楚植物内生菌的具体种类和数量。一般而言，不同地理环境下生长的植物具有的内生菌可能不一样。例如，高纬度地区的植物内生菌种类较少，且多来自子囊菌门;而热带地区植物的内生菌种类则更加丰富[10]。此外，在相似环境下生长的不同植物可能拥有不同的内生菌[11]。随着分子生物学技术的不断发展，利用高通量测序等技术分析微生物的核糖体RNA （rRNA）序列可对植物内生菌进行全面而快速的鉴定[12]，微生物组学（microbiome）也应运而生。尽管如此，這些分子生物学手段未涉及到植物内生菌的分离培养，因此也就无法进行下一步的内生菌开发利用工作。
草莓是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）的多年生草本植物，其果实酸甜可口、营养丰富，是一种具有较高经济价值的水果。目前，针对草莓的微生物组研究主要是围绕草莓根际土壤、果实表面或者叶片表面的微生物类群，针对其内生菌的研究报道很少，不利于草莓内生菌的开发利用[13-20]。开发利用植物内生菌，首要条件就是可以人工分离、培养这些微生物，以进一步分析其生活史、生理生化性状以及与植物的关系。有鉴于此，本试验从健康草莓的根、茎、叶不同部位分离内生真菌和细菌，并利用分子生物学技术进行快速鉴定，分析草莓不同部位内生菌的分布特点和规律，以期为探索利用这些内生菌以促进草莓健康生长奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样品采集
2017年5月在江苏省扬州市施桥镇扬子村任桥露地草莓园（119°43′7.00′′E，32°31′7.00′′N）采集草莓品种章姬（Akihime）为试材。在无病田选取3处进行“S”形取样，共采集15株草莓，整株挖出，用无菌袋低温保存带回实验室。利用自来水冲洗掉植株根部和表面的土壤和残屑，再用无菌水彻底冲洗植株，晾干待用。
1.2 内生菌的分离
分离健康草莓根、茎、叶部的内生真菌和细菌。叶片取样分3个部位（从叶片边缘切取的约5 mm×5 mm的组织、主叶脉中间段2侧切取的约5 mm×5 mm 的组织、5～8 mm的叶柄中段）。根状茎取样分2个部位：韧皮部和木质部各取5 mm×5 mm的组织。根取样分3个部位进行：表皮、皮层和维管束各取5 mm×5 mm的组织。
1.2.1 内生真菌的分离 植物组织置于0.5%次氯酸钙溶液中消毒0.5～1 min，然后在无菌水中漂洗3次，晾干后置放在含0.5 μL/mL 96%乳酸的PDA平板（马铃薯200 g，葡萄糖16.0～20.0 g，琼脂16.0～20.0 g，蒸馏水1 000 mL）上。平板静置于霉菌培养箱（22±2） ℃内培养3 d，长出的菌丝尖端转入新的PDA平板。利用分生孢子进行菌株纯化，获得的单孢株保存于4 ℃。
1.2.2 内生细菌的分离 将植物组织用0.5%次氯酸钙消毒0.5～1 min，然后用无菌水冲洗3次，将组织块加入无菌水中捣碎制成悬浮液，然后吸取100 μL悬浮液用划线法涂布于NA固体培养基（牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水 1 000 mL，pH值7.0，琼脂16.0 g）上，晾干后将培养皿置于30 ℃条件下培养3 d，挑取单菌落进行划线纯化。 1.3 分子生物学鉴定
1.3.1 基因组DNA的提取 在PDA平板表面铺上灭菌的玻璃纸，将真菌菌株接种到玻璃纸上，置于25 ℃培养箱培养3～4 d，再利用金属铲收集玻璃纸上的菌丝。利用杭州爱思进公司基因组DNA试剂盒（AP-MN-MS-GDNA-250）提取菌丝的基因组DNA。
挑取细菌单菌落加入到含有5 mL KB培养液的试管中，30 ℃、200 r/min培养过夜。取1.5 mL菌液离心收集菌体，利用CTAB/NaCl法[21]提取细菌基因组DNA。
1.3.2 PCR扩增 利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列为16S 33F：5′-ATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16S 1387R：5′-TATTGGTGTGACGGGGGGTGT-3′。利用真菌rDNA-ITS （internal transcribed spacer，核糖体基因转录间隔区）通用引物进行PCR扩增，引物序列为ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′。
PCR扩增体系：2 μL 1×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol/L Mg2 、100～300 ng DNA、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，无菌水补齐到 20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸 1 min，31个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，通过胶回收、TA载体克隆，送往上海生工生物工程有限公司进行序列测定。
1.3.3 生物信息学分析 序列提交到NCBI数据库，进行BlastN比对，并登录GenBank。将获得的所有序列进行多重比对，再用MEGA7的Neighbor-Joining法构建系统发育树，采用自举法（bootstrap）对系统发育树进行检验，共1 000次循环，以保证系统树的可靠性。
2 结果与分析
2.1 菌株分离结果
本研究從健康草莓根、茎、叶这3个器官的8个部位采样，分成两等份分别进行细菌和真菌的分离，最后共获得14株真菌菌株和14株细菌菌株（表1）。其中，来自叶片的真菌菌株有8株，细菌菌株有5株;来自茎的真菌菌株有1株，细菌菌株有4株;来自根部的真菌和细菌菌株各有5株。菌株数目的不同可能与不同器官分离的部位数量有一定关系。
2.2 属水平上内生菌的多样性
对细菌菌株的16S rDNA、真菌菌株的rDNA-ITS序列进行扩增、克隆与测序，获得了长度分别为1 455～1 519、563～615 bp的片段序列， 提交GenBank进行登记（表1）。基于这些序列在NCBI数据库中的比较，将菌株鉴定到属或者种水平。由表1可知，分离获得的真菌菌株来自真菌界的4个属：葡萄孢属（Botrytis）、枝穗霉属（Clonostachys）、新拟盘多毛孢属（Neopestalotiopsis）和小不整球壳属（Plectosphaerella）。分离获得的细菌菌株来自原核生物界的6个属：芽孢杆菌属（Bacillus）、新鞘氨醇杆菌属（Novosphingobium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）。细菌的多样性高于真菌。
进一步对分离的菌株进行分析，发现草莓不同部位中可培养内生菌在属水平上呈现出多样性的特点。按照内生菌多样性的丰富度从高到低排列，根部