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研究背景多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种以高雄激素血症、月经不调、慢性不排卵,多囊卵巢,生育能力下降为特点的高度异质性综合征,占育龄期女性的7%左右。PCOS的临床表现以不孕,糖耐量受损、胰岛素抵抗为主,并伴有子宫内膜癌,代谢综合征,糖尿病和心血管疾病的风险增加。PCOS的致病机制非常复杂,其确切病因仍不清楚。之前在中国汉族人群进行的全基因组关联分析筛查到了多个PCOS的易感区域,其中包括受体基因(FSHR,INSR,LHR)及与受体转运相关的基因(Rab5b,DENND1A)。这说明受体功能的障碍可能在PCOS的致病中发挥了重要作用。Rab5是一个调控受体内吞和早期内体融合的小GTP酶,我们发现Rab5基因在调控卵巢颗粒细胞FSH受体及其下游信号通路中起关键作用。此外,Rab5其中的一个亚型Rab5a在PCOS患者颗粒细胞表达异常,这可能与PCOS患者卵巢内分泌紊乱,排卵功能障碍有关。本研究以人卵巢颗粒细胞(KGN颗粒细胞系)为研究模型,采用细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,q RT-PCR)、蛋白印迹杂交(Western blotting)、小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)转染、基因表达载体构建及转染、人颗粒细胞提取等实验技术和方法,研究了Rab5调控颗粒细胞FSH受体内吞和芳香化酶表达的分子机制。研究结果1.人卵巢颗粒细胞免疫荧光结果表明,FSH受体和Rab5蛋白共同定位于颗粒细胞膜上;在FSH短暂刺激下,FSH配体受体复合物内吞,受体在胞膜上的定位减少,胞浆内聚集增多;同时,Rab5蛋白也发生了相同的细胞定位改变。2.KGN细胞转染siRNA敲低Rab5后,分别提取细胞膜蛋白和细胞浆蛋白,Western blotting检测结果表明,Rab5 siRNA(25nM)阻断了FSH刺激下的FSH受体从胞膜到胞浆的转运。3.进一步研究发现敲低Rab5亚型均增加了基础水平及FSH刺激下的芳香化酶的表达。细胞培养基中雌二醇(E2)的水平也相应增加。在Rab5三个亚型中,Rab5a在调控芳香化酶的表达与雌激素的合成起着主要的作用,Rab5b、Rab5c影响较弱。4.为进一步研究Rab5a调控芳香化酶表达的分子机制,Western blotting检测了FSH刺激下的c AMP/PKA/CREB通路。结果表明,siRNA下调Rab5a表达后,FSH刺激下的CREB的磷酸化水平升高。5.转染Rab5a、Rab5b、Rab5c si RNA发现,FSHR m RNA水平均升高,其中敲低Rab5a的效应最明显。进一步检测FSH受体上游的转录因子Usf1和Usf2,发现Rab5a敲低后Usf1和Usf2 m RNA水平显著增加。由此推测Rab5a可能是通过调控FSH受体的表达影响了c AMP/PKA/CREB通路的激活。6.在KGN细胞中转染Rab5a的野生型过表达质粒(GFP-Rab5a:WT),qRT-PCR结果显示过表达Rab5a降低了cyp19A1和FSHR的m RNA水平。7.为进一步研究Rab5a和雌激素合成之间的关系,我们收集了来源于相同刺激方案行体外受精(IVF)术的病人的颗粒细胞。检测了体外培养的黄素化颗粒细胞中Rab5a的表达,并将该结果与患者基础的雌激素水平进行了相关性分析,发现颗粒细胞Rab5a m RNA水平与基础雌激素水平呈负相关。8.检测行IVF术的非PCOS和PCOS患者的黄素化颗粒细胞中Rab5a的表达,发现PCOS患者颗粒细胞的Rab5a基因表达较对照低,此结果在肥胖或非肥胖患者中均有显著差异(P<0.05)。结论我们的研究结果表明,Rab5可以调控FSH刺激下的FSH受体从细胞膜到细胞浆的转运过程;同时介导了FSH的信号传导;敲低Rab5的三个亚型Rab5a、Rab5b和Rab5c均能促进芳香化酶的表达,其中Rab5a的作用更明显;Rab5a对芳香化酶的调控作用是通过调节FSHR的转录因子Usf1和Usf2实现的;Rab5a基因在PCOS患者的黄素化颗粒细胞中存在表达的异常,这可能与PCOS的FSHR表达升高有关。本研究聚焦于PCOS易感基因Rab5的功能研究,为PCOS发病的分子机制的阐明提供了新的思路。