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Citreamicins由Carter等人在1989年从Micromonospora citrea的发酵液体当中分离得到的,这类化合物具有重要的生物活性,通过体外实验发现它们能够抑制革兰性阳性细菌和厌氧细菌。本文通过提取Citreamicins抗生素产生菌Micromonospora citrea NRRL18351的总DNA,用Sau3AI对总DNA进行部分酶切,目的是能够从Micromonospora citrea NRRL18351基因组中获得片段大小在35到40kb的目的DNA,满足基因组文库的构建。然后对部分酶切的目的片段进行割胶回收,通过连接酶与载体pJTU2554进行连接,并包装、转染到大肠EPI300中,最终构建成包含有Micromonospora citrea NRRL18351基因片段的基因组文库。然后,根据已经报道的抗生素lysolipin、xantholipin、kigamicins与Citreamicins化学结构的相似性,通过同源比对来设计简并性引物。并使用该对引物,以Micromonospora citrea NRRL18351的总DNA作为PCR扩增的模版,进行扩增可以获得同源片段。因此,采用该探针对所构建的基因文库(19个96孔板)进行筛选,从中筛选出了7个阳性克隆分别命名为1A3、1E5、7D1、11B12.15B8、16D4、19D8、另外,以设计的简并性引物扩增Micromonospora citrea NRRL18351基因组上的目的片段,并回收作为标记探针,对所筛选出来的7个阳性克隆进行DNA杂交。同时,将筛选出来的7个阳性克隆进行异源表达,通过原生质体转化的方法转到表达菌株S.lividanseK4当中,但在转化出来的菌株中,通过培养发酵并没有在发酵液当中检测到Citreamicins抗生素组分的产生,因此猜想可能这7个阳性克隆并没有合成Citreamicins抗生素完整的基因簇或者异源表达所产生Citreamicins抗生素产量太低无法检测到。因此为了进一步探索这7个阳性克隆是否含有Citreamicins抗生素生物合成的基因簇,将7个阳性克隆用StuI进行酶切,然后,用T4连接酶使它们发生自连,转化到DH5a当中,挑选出载体发生自连的质粒,对获得的质粒用酶SpeI和XbaI进行双酶切,得到载体片段及所需要的目的片段。然后,通过将该目的片段连接到载体pJTU412上,之后筛选连上目的片段质粒并通用StuI酶切,在质粒上再连上Apra抗性基因作为筛选标记。最终构建成功了3个敲除载体,分别命为是Pllx4, Pllx5和Pllx6。通过接合转移,将这3个敲除载体与Micromonospora citrea NRRL18351做敲除实验,以此来确定这些质粒当中是否包含有合成Citreamicins抗生素的基因簇。