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研究目的:胰腺癌是发病率及死亡率均较高的实体肿瘤,其五年生存率仅为10%。目前,治疗胰腺癌的主要手段包括手术、化疗和放疗,在一定程度上能够控制胰腺肿瘤的生长,然而胰腺癌细胞恶性程度高,极易发生复发、转移以及多要耐药,患者预后不佳。肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）,亦称肿瘤起始细胞（Tumor initiating cell,TIC）是一类具有自我更新、多能分化和高度成瘤性的细胞亚群,与肿瘤形成、复发、转移以及治疗耐受密切相关。因此,寻找识别胰腺癌TIC细胞的特异分子标记物,探索调控TIC功能的分子机制,是研究者关注的热点问题,有可能为胰腺癌治疗提供新的手段。我们发现电压依赖性钙离子通道亚基CACNA2D1（亦称α2δ1）能够识别多种实体瘤TIC,包括肝癌、胃癌、肺癌和乳腺癌。然而,α2δ1能否成为胰腺癌TIC的特异性功能标志物以及通过怎样的分子机制调控干性特征,尚未进行深入系统的研究。因此,本课题深入研究α2δ1识别胰腺癌TIC细胞亚群的作用,探索α2δ1通过钙离子影响钙/钙调素依赖蛋白激酶2D（CaMK2D）活性,调节丙酮酸激酶2（PKM2）磷酸化的分子机制,进而阐明靶向抑制α2δ1调控信号对于胰腺癌的潜在治疗作用。研究方法:我们制备了针对于α2δ1的单克隆抗体Mab 1B50-1。采用荧光标记抗体技术标记Mab 1B50-1抗体,用于流式细胞分析和分选;利用流式细胞分析α2δ1在胰腺癌细胞PANC-1、BxPC-3、ASPC-1、MIA PaCaII和胰腺癌组织中的表达情况;使用流式细胞分选技术分选出α2δ1阳性和阴性的细胞群,完成球体形成、实时定量酶链聚合反应（RT-PCR）、蛋白免疫杂交（western blot）和动物实验等。使用RT-PCR和Western blot检测TIC相关基因在α2δ1阳性和阴性胰腺癌细胞中的表达水平。基因敲减及过表达技术验证α2δ1等基因在不同状态下对于TIC特性的影响。选取74名胰腺癌手术切除标本,利用免疫荧光技术检测α2δ1在肿瘤及癌旁组织中的表达情况,分析α2δ1阳性表达与临床指标的关系。通过测序技术和生物信息分析,发现α2δ1下游调控靶点为CaMK2D;质谱分析和免疫共沉淀（CO-IP）技术筛选到PKM2为CaMK2D相结合蛋白。PKM2敲除技术和PKM2-Y105位点突变为磷酸化活性状态（PKM2-Y105D）或者非活性去磷酸化状态（PKM2-Y105F）,验证Y105位点磷酸化对于TIC特征的调控作用。免疫荧光实验检测磷酸化PKM2的定位。运用NOD-SCID小鼠建立胰腺癌细胞致瘤模型（Cell derived xenograft,CDX）和患者肿瘤组织致瘤模型（Patient derived xenograft,PDX）。Mab 1B50-1和胰腺癌化疗药物（吉西他滨）单独或联合处理CDX和PDX小鼠模型,观察对于胰腺癌肿瘤生长的抑制作用。研究结果:α2δ1定位于肿瘤细胞膜表面,在胰腺癌肿瘤组织和细胞系表达的阳性比率为1.3-5%。α2δ1阳性细胞的球体形成率和肿瘤形成率明显高于α2δ1阴性细胞,阳性细胞的第二次球体和肿瘤形成率进一步升高,即α2δ1阳性细胞具有自我更新能力。α2δ1抗体1B50-1或敲减α2δ1能够明显抑制α2δ1阳性胰腺癌细胞的自我更新能力。α2δ1阳性细胞干性相关基因表达水平明显高于阴性细胞亚群;阳性细胞在含血清培养基中培养2周后,其α2δ1阳性率回到与亲本细胞相似的水平,即具有分化能力。敲低α2δ1降低了胰腺癌细胞的球体形成、肿瘤形成以及干性相关基因的表达水平,过表达α2δ1提高了肿瘤细胞的成球性、致瘤性和干性相关基因的表达水平。α2δ1阳性细胞比已经报道的TIC表面标志物包括EpCAM、CD44和DCLK阳性细胞亚群具有更高的成球率和肿瘤形成比率。α2δ1在胰腺癌肿瘤组织中的表达率（66/74）高于癌旁组织（44/74）,癌旁组织α2δ1阳性表达与患者淋巴结转移、神经浸润和生存期短正相关,是胰腺癌预后的独立因素。此外,高通量测序分析发现α2δ1能有效调控CaMK2D的蛋白表达和活性,α2δ1阳性细胞中CaMK2D的表达率显著高于阴性细胞。CaMK2D过表达增强胰腺癌细胞球体形成、成瘤能力和干性基因的表达水平,而敲低此基因则明显抑制了这些TIC特征。进一步的实验数据显示CaMK2D与PKM2能够形成复合物,PKM2-Y105位点发生磷酸化促进PKM2入核,激活TIC干性基因;阻断Y105位点的磷酸化后,PKM2的入核被抑制,胰腺癌细胞的干细胞特性相应减弱。动物实验结果证明,α2δ1抗体1B50-1联合吉西他滨比单药组和对照组显著抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期。联合用药组的肿瘤组织中α2δ1阳性细胞的比例明显下降。研究结论:α2δ1通过激活钙离子通道相关蛋白CaMK2D,并促进丙酮酸激酶相关蛋白PKM2发生磷酸化（Y105位点）,维持胰腺癌TIC干性状态。α2δ1能够作为识别胰腺癌TIC的细胞表面功能性标志物,靶向抑制α2δ1对于胰腺癌具有治疗作用。我们的研究进一步丰富了 TIC干性维持的调控机制,提出了胰腺癌治疗的新手段。