重症肌无力（Myasthenia Gravis, MG）是一种发生在神经肌肉接头（Neuromuscular junction，NMJ）传递障碍的获得性自身免疫性疾病，病变主要累及神经-肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体（Acetylcholinereceptor，AChR）；该病是严重危害患者身心健康的常见的神经系统疾病之一。因该病具有明确的抗原—AChR、抗体—乙酰胆碱受体抗体（nicotinicacetylcholine receptor antibody，AChRAb）及病理作用靶点—NMJ，是研究自身免疫性疾病发病机制和防治的理想模型之一。MG患者的主要临床症状为横纹肌收缩无力，最常见症状为眼外肌收缩无力，严重者累及全身肌肉，部分患者累及呼吸肌，出现呼吸肌麻痹，发生肌无力危象而死亡。临床根据受累部位及表现不同，将MG分为眼肌型MG（Ocular myasthenia gravis，OMG）（Ⅰ型，仅累及眼外肌，表现为眼外肌麻痹、无力为主，可出现波动性的眼睑下垂、复视等）和全身型MG（Generalized myasthenia gravis，GMG）（Ⅱ型~Ⅴ型，累及四肢骨骼肌和/或咽喉肌，表现为全身骨骼肌麻痹、无力为主，出现四肢及躯干肌肉麻痹、无力，甚至出现呼吸肌麻痹、无力，发生肌无力危象、死亡等）。半个多世纪以来，MG发病机制的研究一直是神经病学和免疫学领域共同关注的热点之一。MG患者胸腺长期处于一直慢性炎症状态，80~90%的MG患者存在胸腺组织的异常，主要表现为胸腺增生、囊肿、坏死、肥大，或者合并胸腺瘤等。切除病变胸腺，或者对于难治性MG患者来说，切除貌似正常实则可能慢性炎症的胸腺，均可使MG患者临床症状得到有效缓解，而且在手术切除胸腺后患者的细胞免疫、体液免疫均受抑制，AChRAb减少，表明胸腺在诱导和维持MG的发生、发展过程中起非常重要的作用。因此，有推测诱发MG患者免疫异常的始动部位是胸腺，但是MG患者的胸腺内究竟发生了什么样的异常免疫反应仍然不清楚，深入研究MG患者胸腺内发生的异常免疫反应与OMG和GMG患者不同临床症状之间的联系，对阐明MG的发病机制及治疗具有重要意义，对其他自身免疫性疾病的防治也有重要的指导意义。本研究拟采用免疫组织化学（Immunohistochemical，IHC）技术、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术、实时定量聚合酶链反应（Real-Time polymerase chain reaction，R-T PCR）、单核苷酸多态性（singlenucleotide polymorphism，SNP）及免疫印迹（Western-blot，WB）等方法分析OMG和GMG患者胸腺不同的分子表达，以期阐述胸腺内发生的异常免疫反应与OMG和GMG患者不同临床症状之间的联系。第一部分OMG、GMG患者合胸腺瘤时胸腺的不同分子表达目的1.分析OMG和GMG合并胸腺瘤患者发病年龄、性别及病程之间的差异。2.分析Foxp3和CXCL13在OMG和GMG合并不同组织学类型胸腺瘤时的不同表达。方法取2003~2010年唐都医院MG合并胸腺瘤患者病理标本（胸腺）为研究对象，共计胸腺瘤患者311例。合并MG患者116例，符合纳入标准、最终纳入患者58例，其中OMG合并胸腺瘤患者35例，GMG合并胸腺瘤患者23例，胸腺瘤无MG（None with MG，Non-MG）患者73例为对照组。使用SPSS13.0分析MG患者合并胸腺瘤一般资料，采用IHC分析Foxp3和CXCL13在不同胸腺瘤组织学类型MG患者胸腺的表达。结果与GMG合并胸腺瘤患者对比，OMG合并胸腺瘤男性患者多为晚发型，发病年龄较GMG合并胸腺瘤晚（P=0.037），而女性GMG、OMG患者合并胸腺瘤起病在起病年龄上的差异并不明显（P=0.126）。与OMG患者胸腺分子表达相比，Foxp3的表达在GMG组AB型、B1型、B2型胸腺瘤患者中较低，其中AB型、B1型差异显著，有统计学意义（P=0.001,0.043）。与OMG患者胸腺分子表达相比，CXCL13在GMG合并B1、B2型胸腺瘤患者的胸腺中表达均较高，有统计学意义（P=0.027,0.048）。而且，与Non-MG患者的胸腺分子表达相比，GMG合并胸腺瘤AB型患者胸腺中，CXCL13的表达高，且有统计学意义（P=0.003）。结论GMG和OMG患者合并胸腺瘤时，在起病年龄、性别上存在明显的差异。同时，OMG和GMG患者合并不同组织学类型的胸腺瘤，其分子表达也存在明显差异，提示胸腺瘤组织学类型与分子的表达可能均参与影响了MG的不同临床类型。第二部分OMG、GMG患者合胸腺增生时胸腺的不同分子表达目的1. IHC、R-T PCR分析CD4、CD25、Foxp3和CXCL13在婴儿胸腺、成人萎缩胸腺、胸腺增生Non-MG患者胸腺的不同表达。2. IHC、R-T PCR分析CD4、CD25、Foxp3和CXCL13在OMG、GMG、Non-MG合并胸腺增生时患者胸腺的不同表达。3.分析CD4、CD25、Foxp3和CXCL13表达的不同与OMG、GMG患者病情的相关性。方法取2008~2011年唐都医院MG合并胸腺增生患者病理标本为研究对象，共计MG合并胸腺增生患者52例，纳入患者34例，其中OMG合并胸腺增生患者14例，GMG合并胸腺增生患者20例，Non-MG患者6例为对照一组，6例肺癌患者，胸腺处于成人萎缩状态为对照二组，12例婴儿胸腺为对照三组。结果IHC结果显示，CD4和Foxp3的表达在胸腺增生是否合并MG患者及对照组的组间比较，未见明显差异。CD25和CXCL13组间比较差异明显：CD25高表达于婴儿胸腺，在正常成人胸腺中也有表达，但较低，合并胸腺增生时最低。而在胸腺增生合并MG时则表达增高，尤其在合并GMG时表达最高。CXCL13在婴儿胸腺、正常成人胸腺及胸腺增生时表达均较低，组间未见明显差异。而在合并OMG时表达升高，GMG时表达最高。R-T PCR结果与IHC结果基本相似。相关性分析发现，CD25和CXCL13的表达与MG患者病情中度相关。结论合并胸腺增生时，OMG和GMG患者胸腺存在不同的分子表达，而婴儿胸腺、成人萎缩胸腺及胸腺增生合并Non-MG时的分子表达也不同。研究提示，CD25水平降低可能与人类的衰老有关。CD25、CXCL13在MG合并胸腺增生患者的表达与MG患者临床症状呈正相关。提示CD25、CXCL13可能是MG患者疾病严重性的一个标志物。第三部分Tfh细胞在OMG、GMG患者合胸腺异常时的不同分子表达目的1. CD4~+CXCR5~+T细胞在OMG、GMG合并胸腺瘤时的不同表达。2. IHC、IF、WB、SNP与R-T PCR分析OMG、GMG合并胸腺瘤时CXCR5、Bcl-6、ICOS、IL-21表达的差异。方法取2009~2011年唐都医院MG合并胸腺瘤患者胸腺标本为研究对象，其中OMG合并胸腺异常患者21例，GMG合并胸腺异常患者18例，Non-MG合并胸腺异常患者19例为对照组。采用IHC、IF、R-T PCR、WB、SNP分析Tfh细胞在胸腺异常合并OMG、GMG患者胸腺的表达。本研究以CD4~+CXCR5~+代表Tfh细胞，激光扫描共聚焦显微镜（laser scanningconfocalmicroscope，LSCM）观察Tfh细胞在不同组间的表达，SNP观察有无碱基的突变，WB定量目标分子的蛋白水平、R-T PCR定量目标分子的转录水平。结果本研究发现，CD4~+CXCR5~+T细胞在GMG患者胸腺的表达最高，其次是在OMG患者胸腺表达，而在Non-MG的患者胸腺中，表达最低。WB技术及IHC技术分别定量、定位证明，ICOS、Bcl-6的表达在GMG组最高。SNP发现MG患者存在ICOS碱基的突变；而R-T PCR结果显示，与正常成人胸腺对比，CXCR5、ICOS、Bcl-6的表达，在GMG组最高，其次是OMG组。而与Non-MG患者胸腺相比，OMG患者胸腺CXCR5、ICOS、Bcl-6的表达未见明显增高。IL-21在GMG组最高，充分说明GMG患者胸腺可能存在过度的B细胞活化使得抗体分泌增多，IL-21的表达同时在Non-MG患者胸腺表达增高，充分说明胸腺异常患者MG的易感性增加。高表达IL-21可以作为MG发病的高危因素。结论通过IHC、IF、WB、SNP、R-T PCR在不同层面论证了ICOS，Bcl-6和IL-21在GMG患者胸腺中CD4~+CXCR5~+T细胞表达均升高，且明显高于OMG患者，这些发现表明Tfh细胞在OMG和GMG不同的临床症状中发挥了重要的作用。