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第一部分 和厚朴酚通过改善线粒体功能对阿霉素心脏毒性的保护作用研究研究目的:阿霉素（Doxorubicin,Dox）是广泛用于临床实践的有效抗癌药物之一。但这类化疗药物主要副作用是心脏毒性,引起心肌细胞损伤,最后导致心力衰竭。一系列表明研究,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）诱导的线粒体的损伤是造成阿霉素心脏毒性作用的因素之一。阿霉素诱导的心脏损伤已被证实与线粒体功能障碍,氧化应激,DNA和蛋白质合成受损,肌原纤维变性和心肌细胞凋亡等密切相关。中药厚朴其性味苦、辛,温。厚朴是具有燥湿消痰,下气除满功效的常用中药。而和厚朴酚属于其主要活性成分之一。在已发表的文献中,和厚朴酚已被被证明具有广泛的药理作用,如抗肿瘤,抗菌,抗高血压,以及对压力超负荷心脏肥大和心律失常的保护作用。然而,和厚朴酚对阿霉素心脏毒性的影响以及其作用机制仍不清楚。这部分实验通过建立急性和慢性阿霉素心脏毒性模型,探讨和厚朴酚对阿霉素心脏毒性的影响以及其作用机制。研究方法:1.建立急性小鼠阿霉素心脏毒性模型。使用Oxygraph-2k线粒体功能测定仪对小鼠线粒体的氧消耗进行测量,观察和厚朴酚对阿霉素诱导的心脏毒性的线粒体呼吸功能影响。2.双荧光素酶报告基因系统检测和厚朴酚对过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome Proliferators-Activated Receptors,PPARs）反应元件（PPRE）和过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma,PPARγ）启动子活性。用实时定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）检测PPARγ以及PPARγ靶基因(超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase 2,SOD2）和脂肪酸转位酶（Fatty Acid Translocase,FAT/CD36）在心脏中的表达。通过 Western blot检测关于PPAR γ的蛋白表达水平。3.检测小鼠心脏组织中还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）和氧化型谷胱甘肽（Glutathione Oxidized,GSSG）水平,荧光探针-二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）用于测定心脏组织中ROS水平。4.免疫组化检测小鼠心脏组织炎症标记物CD68表达。5.测量小鼠体重,心重,胫骨长度等指标,以及测定乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活力。超声心动图检测心功能变化,包括左心室射血分数（Ejection Fraction,EF%）、左心室短轴缩短率(（Fractional Shortening FS%）。6.通过Western blot检测caspase的活化的蛋白表达水平以及TUN EL法观察和厚朴酚对阿霉素诱导心肌细胞的凋亡的影响。结果:1.与阿霉素组相比,和厚朴酚干预后使小鼠心脏线粒体的最大氧化磷酸化、最大解偶联呼吸、泄漏CⅠ+CⅡ呼吸、呼吸控制比率均有所上调。2.和厚朴酚能够增强PPAR反应元件（PPRE）和PPARγ的启动子活性,并且增加PPAR γ以及PPAR γ靶基因SOD2、CD36的mRNA水平。同时增加PPAR γ蛋白表达水平。3.和厚朴酚能够使DHE荧光强度显著下调,同时使GSH/GSSG 比率增加。4.和厚朴酚能够减少心脏组织的炎症标记物CD68表达。5.和厚朴酚干预后,小鼠的体重、心重/胫骨长度比等增加,乳酸脱氢酶（LDH）活性减少,心脏EF%,FS%增加。6.和厚朴酚能够减缓阿霉素诱导的心肌凋亡。结论:1.和厚朴酚能够促进心脏线粒体呼吸以及改善阿霉素诱导的心脏线粒体呼吸的受损。2.PPAR γ活化可能有助于和厚朴酚的线粒体效应。3.和厚朴酚对阿霉素处理小鼠的抗炎作用与激活PPAR γ有关。4.和厚朴酚治疗能够通过促进线粒体呼吸和发挥抗氧化和抗炎作用从而达到保护心脏免受阿霉素心脏毒性的损害。其机制不仅通过抑制线粒体蛋白质乙酰化而且还通过激活PPARγ信号传导。第二部分 寡霉素敏感相关蛋白在细胞线粒体能量代谢中的功能研究研究目的:ATP合酶在有氧条件下提供大部分细胞ATP。寡霉素敏感相关蛋白（oligomycin sensitivity conferring protein,OSCP）是 ATP 合酶的亚基。OSCP 缺乏,ATP 合酶的稳定性会被破坏。其对细胞正常的能量代谢发挥重要的作用。但是OSCP具体的功能尚不明确,需要进一步研究。通过CRISPR/Cas9技术构建OSCP基因缺失的人肝癌细胞HepG2（Δ OSCP）,解析OSCP在细胞线粒体代谢中的功能及其作用机制。研究方法:1.通过CRISPR/Cas9技术,构建OSCP基因缺失的HepG2细胞。2.通过细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK8）检测细胞的生长活力。3.通过不同时间点的细胞计数以及EdU免疫荧光染色,分析细胞的增值情况。4.采用流式细胞术检测细胞周期分布情况。5.通过免疫印迹和蓝色非变性凝胶电泳技术检测细胞的线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的相关蛋白表达水平;用银染分析细胞的蛋白复合物组分的变化情况。6.采用线粒体能量分析仪检测细胞的氧消耗率（Oxygen consumption rate,OCR）和胞外酸化率（Extracellular acidification rate,ECAR）,观察细胞的氧化磷酸化和糖酵解水平。7.通过免疫印迹检测细胞的自噬相关蛋白（PTEN induced putative kinase 1（PINK1）,P62,LC3Ⅱ）的表达情况。8.通过免疫印迹检测细胞中线粒体动态变化相关蛋白的表达,包括线粒体分裂调控相关蛋白:发动相关蛋白1（Dynamin-related protein 1,Drp-1）和分裂蛋白1（Fission 1 protein,Fis-1）以及线粒体融合调控相关蛋白:融合蛋白1（Mitofusins 1,MFN1）、融合蛋白 2（Mitofusins 2,MFN2）和视神经萎缩蛋白 1（Optic atrophy 1,OPA1）。9.实时荧光定量PCR检测细胞中线粒体DNA拷贝数的变化。10.采用星孢菌素（STS）处理细胞,24小时后,运用Annexin V/PI流式细胞术进行检测细胞的凋亡情况。研究结果:1.筛选单克隆细胞验证,成功构建了 OSCP基因缺失的人肝癌细胞HepG2（ΔOSCP）。2.与野生型细胞相比,OSCP基因缺失的细胞活力明显的抑制。并且不同时间点（24小时,48小时,72小时）的细胞增殖能力均明显抑制。3.与野生型细胞相比,OSCP基因缺失细胞的细胞周期明显改变。OSCP基因缺失的细胞S期细胞比例明显下降,G1期比例显著增加,G1期明显的阻滞,不能进入正的细胞周期。4.Western-blot和蓝色非变性凝胶电泳结果均显示与野生型细胞相比,OSCP因缺失的细胞线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的相关蛋白表达均下调。5.与野生型细胞相比,OSCP基因缺失的细胞氧化磷酸化水平下降,具体为细胞基础呼吸、ATP产量、线粒体的最大耗氧能力均下降。另外,与野生型细胞相比,OS基因缺失的细胞糖酵解水平则增加,表现为糖酵解能力以及最大糖酵解能力均增加6.Western-blot结果显示与野生型细胞相比,OSCP基因缺失的细胞自噬相关白改变,具体为PINK1蛋白表达上调,LC3-Ⅱ蛋白表达上调,而p62蛋白表达下调7.Western-blot结果显示与野生型细胞相比,OSCP基因缺失的细胞线粒体分调控相关蛋白情况为Fis-1蛋白表达显著上调,Drp-1在两组细胞中的表达无明显异;而线粒体融合调控相关蛋白则表现为MFN1、OPA1蛋白表达均下调,而MFN2的白表达在两组细胞之间没有显著差异。8.与野生型细胞相比,OSCP基因缺失的细胞线粒体DNA拷贝数减少。研究结论:1.OSCP是HepG2细胞增殖所必需的。2.OSCP基因缺失的细胞会导致线粒体呼吸链复合物稳定性失调。3.OSCP基因缺失的细胞会引起细胞能量代谢变化。4.OSCP基因缺失的细胞可能会引起自噬激活。5.OSCP基因缺失的细胞诱导线粒体动态变化。