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在已构建pMBL载体的基础上，参照Lac启动子序列设计引物，从质粒pUC18上扩增出260bp大小的片段，定向克隆入pMBL载体，获得含可调控启动子(Plac)的跨膜输出蛋白基因选择克隆载体pMB-Lac，大小为3.72kb。参照Ara启动子序列设计引物，从E．coli基因组上扩增出阿拉伯糖启动子及其调控基因，定向克隆入pMBL载体，构建成另一个跨膜输出蛋白基因选择克隆载体pMB-Ara，大小为4.74kb。经酶切鉴定和测序，证明构建的载体与预期设计的一致。为证明pMB-Lac／pMB-Ara2个跨膜输出蛋白基因选择克隆载体的有效性，从质粒pBR322上PCR扩增缺失启动子的已知跨膜输出蛋白基因B—四环素抗性基因片段(△P Tet，315bp)，EcoRⅠ／BamHⅠ双酶切末端，分别与用EcoRⅠ／BamHⅠ、EcoRⅠ／BglⅡ、EcoRⅠ／BclⅠ双酶切的载体连接。经Kan+Amp+IPTG／Kan+Amp+Arabinose平板筛选，在EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切载体(+2位)的连接产物中获得阳性转化子。经酶切和测序确认△P Tet基因已以阅读框对位的方式插入，Lac／Ara启动子驱动了△P Tet基因和报告基因(△P△SP Amp)的融合表达和跨膜分泌。为评估载体骨架上MCS上游启动子或潜在的启动子对克隆基因的漏表达影响，将△P Tet基因片段克隆到不含启动子的原始质粒pMBL，构建pMBL△PTet阴性对照质粒，结果转化子在Kan平板中生长，而在Amp+Kan平板上无论是否诱导或使用何种诱导剂诱导仅在Amp 16(浓度单位为mg／L)时有少量生长。为探讨pMB-Lac／pMB-Ara 2个载体中的Lac和Ara启动子的可调控范围、漏表达的程度及诱导的最适条件，对构建的pMB-Lac△PTet、pMB-Ara△PTet载体的转化子进行不同诱导剂及浓度的诱导表达，并使用不同的Amp浓度进行筛选，为排除△PTet在去除启动子时对其SD序列可能造成的破坏，用T7-SD序列直接与Tet基因编码区拼接，构建了pMB-Lac△PT7-Tet质粒，并与pMB-Lac△PTet进行对照。结果pMB-Lac△PTet和pMB-Lac△PT7-Tet的转化子经1.5mM的IPTG诱导在Amp16、32、64平板中均有一定程度的生长，相比较相同条件下带T7-SD序列的转化菌生长优于带Tet-SD序列的转化菌。pMB-Ara△PTet转化子在0.5％的阿拉伯糖诱导下在Amp 16、32、64、128平板上均生长良好，但细菌生长速度慢于在对照平板上的生长速度；应用不同浓度的阿拉伯糖进行诱导，结果用1.25％的浓度诱导时，细菌在Amp50平板上与在对照的Kan平板上菌落数相近；而用0.3-1.25％和1.25-10％浓度的阿拉伯糖诱导时，细菌菌落数均较1.25％的浓度诱导时低。应用无抗性液体培养基连续转接传代10次和20次，分析了构建的重组质粒的遗传稳定性，结果显示质粒丢失不明显，质粒骨架稳定。进一步选择pMB-Ara载体试用于多杀性巴氏杆菌C48-19菌株的外膜蛋白基因的克隆。提取细菌的基因组DNA，用Sau 3AⅠ部分酶切，回收800bp-1kb的部分酶切片段，并与用EcoRⅠ／BamHⅠ、EcoRⅠ／BglⅡ、EcoRⅠ／BclⅠ双酶切的pMB-Ara载体连接，转化产物分别用Amp+Kan平板和Amp+Kan+1.25％arabinose平板筛选。于Amp+Kan平板上挑取克隆子，PCR扩增出插入的膜蛋白基因片段，并混合，标记为探针，与Amp+Kan+1.25％arabinose平板上获得的克隆子杂交，筛选到5个表达差异的克隆(为62~#、88~#、89~#、107~#和108~#克隆)。可诱导性验证结果进一步证实了88~#克隆在Amp+Kan平板中不生长而在Amp+Kan+1.25％arabinose平板中生长，推断88~#克隆的Amp活性是由载体所带的Ara启动子所驱动的，而19~#克隆在两种平板中均能生长，表现为组成型表达的特点。序列测定、BLAST同源查找以及SigalP信号肽预测等结果显示，88~#克隆外源插入片段全长827bp，含有完整的启动子序列结构，且与多杀性巴氏杆菌Pm70的artl基因高度同源，推测该基因的启动子为E．coli中沉默的启动子，可能只在特殊诱导条件下才开放。而19~#克隆子克隆834bp的基因片段，对应于一功能未知的unknown基因(PM0741基因，784aa)，为组成型表达的跨膜蛋白基因。该载体系统能有效地用于病原菌膜蛋白基因的选择克隆。该载体系统的建立，为进一步研究多杀性巴氏杆菌毒力、免疫原性等相关的跨膜蛋白及其基因的功能和表达调控等奠定基础。