表观遗传调控是在基因DNA序列不发生改变的前提下,基因的功能发生了变化,并且这种变化是可遗传的,包含几种调节方式:DNA甲基化、核小体定位、染色质重塑及组蛋白修饰等。DNA甲基化是其中一种很重要的调控方式,它是指在DNA甲基转移酶的催化作用下,将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基团转移到DNA分子上,这种变化一般发生在胞嘧啶上。DNA甲基化需要DNA甲基转移酶维持,DNA甲基转移酶突变时,可引起某些基因的启动子发生高度去甲基化,从而导致该基因的高表达,说明DNA甲基化对生物体有很重要的意义。植物中DNA甲基化可发生在CG、CHG、CHH（H=A、T或C）序列上。DNA甲基转移酶分为两种:从头合成甲基转移酶和维持型甲基转移酶。植物中主要有三类DNA甲基转移酶:维持型甲基转移酶MET1,主要负责维持CG甲基化;从头合成甲基转移酶DRM2,主要负责从头甲基化;植物中特有的甲基转移酶CMT3,主要负责维持CHG甲基化。EFD是本实验室前期研究中发现的一个与拟南芥花药早期发育相关的基因。相应的efd突变体有早期花药败育的表型。生物信息学比对分析发现:EFD具有与典型甲基转移酶相同的三维结构,暗示EFD编码一个DNA甲基转移酶。通过同源比对,发现拟南芥中有5个EFD的同源基因,同样具有甲基转移酶结构域,表明它们也可能具有甲基转移酶活性。本论文意在观察EFD同源基因的表达模式及相应单突变体的表型,通过寻找EFD及同源基因的靶序列,研究它们的甲基转移酶活性,以及将EFD及同源蛋白与典型的DNA甲基转移酶相比较,探究相互之间的异同。初步实验结果如下所示:1.通过表达模式观察我们发现EFD同源基因在拟南芥的花药、根、叶中均有表达;通过花粉体外萌发实验,我们发现EFD同源基因单突变体的花粉萌发率比野生型低,但角果并无明显败育现象。2.通过亚硫酸氢盐测序法检测,我们发现在EFD及同源基因单突变体背景下,研究DNA甲基转移酶的文献中常检测的序列ERT1、ERT2的甲基化明显低于野生型的甲基化水平。为了进一步确认,我们通过荧光定量PCR实验发现,ERT1、ERT2在突变体背景下的表达水平明显上调,说明ERT1、ERT2为EFD及同源基因的靶序列。并且通过甲基化敏感性内切酶酶切实验证明ERT3、ERT4也为EFD及同源基因的靶序列。3.实验室前期EFD体外酶活检测实验结果显示:EFD可能具有从头合成DNA甲基转移酶的功能,那么为了检测EFD的同源蛋白的功能,我们构建了EFD同源基因的蛋白表达载体,体外诱导表达蛋白,通过甲基化敏感性内切酶酶切实验及亚硫酸氢盐测序实验并没有发现EFD同源蛋白有将DNA从头甲基化的功能。4.体内研究EFD及同源基因的甲基化功能。我们购买到ert1突变体,将其与efd及其同源基因单突变体杂交,筛选F2代与野生型基因型相同的植株检测ERT1的甲基化水平与表达水平,结果发现ERT1的甲基化水平并没有上升,说明EFD及同源基因没有将ERT1的甲基化恢复至野生型水平。同时,我们构建EFD转基因恢复载体,将其转入efd突变体,筛选后代恢复育性的植株检测ERT1的甲基化水平,结果显示ERT1的甲基化水平没有上升,同样说明EFD并没有恢复ERT1的甲基化水平。5.前期实验结果证明EFD及同源基因会影响基因组某些位点的甲基化,为了比较其与植物中典型甲基转移酶的异同,我们对植物中典型甲基转移酶的靶序列MEA-ISR、ATSN1、LTR2、ERT1、ERT2、ERT3、IBM1进行甲基化检测,结果显示除ERT1、ERT2、ERT3外,其它基因不受EFD及同源基因调控。