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自噬是真核细胞利用溶酶体降解大分子物质的途径,它通过形成双层膜结构包裹细胞内受损的细胞器及其它大分子物质,再运送到溶酶体中降解成氨基酸、脂肪酸和核苷等基本单元,从而维持细胞正常的能量循环。肿瘤是最早发现与自噬相关的疾病之一。然而,自噬在肿瘤发生和发展中的作用却尚无定论。一方面,自噬可促进肿瘤生存并维持其活性,帮助肿瘤细胞抵御低氧、营养缺乏、DNA损伤和氧化应激等不利环境；另一方面,自噬也可以作为肿瘤细胞死亡的途径,并且在某些情况下还可能诱导肿瘤细胞发生凋亡。NF-κB是另一种在肿瘤的形成和增殖过程中起重要作用的核转录因子,它可以通过上调IAPs家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、JNK、c-FLIP等与细胞存活、增殖相关的基因表达或诱导凋亡抑制基因过表达而发挥抗凋亡作用。许多肿瘤细胞中均存在NF-κB的持续高表达及IκBα的突变失活或降解异常,导致上调多药耐药基因的表达水平,使肿瘤细胞产生抗药性。因此,通过阻滞NF-κB活化已成为治疗某些肿瘤的新策略。青蒿素(Artemisinin)是我国研究者在二十世纪七十年代首次从菊科植物黄花蒿(Artemisia annua Linn)中提取的一种新型倍半萜内酯。二氢青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA)是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢物。近年来的研究证实,二氢青蒿素具有良好和广谱的抗肿瘤活性。本课题组的前期研究也表明,二氢青蒿素对肺癌(Lewis)、人多发性骨髓瘤(RPMI8226)以及白血病(K562,HL60)细胞等多种肿瘤细胞的增殖均具有明显的抑制效果。我们最近又发现二氢青蒿素能显著诱导多株肿瘤细胞发生自噬反应。关于二氢青蒿素诱导肿瘤细胞发生自噬的作用还未见报道,其具体机制更不甚清楚。本论文选取人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞株作为主要研究对象,重点考察NF-κB通路在二氢青蒿素诱导肿瘤细胞自噬中的作用机制。结果：1.DHA诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞发生自噬RPMI8226细胞经DHA (10μM,20μM,40μM)作用24h后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ型的表达明显上调,p62的表达下调,并且LC3蛋白由对照组的弥散状态变成明显点状聚集,且主要分布在细胞质中。吖啶橙染色后,通过荧光显微镜和流式细胞仪分别发现,DHA (10μM,20μM,40μiM)作用24h后,RPMI8226细胞内酸性自噬泡的数量明显增加。细胞经氯喹(5μM,30min)预处理后,发现氯喹可增强DHA(20μpM,24h)诱导RPMI8226细胞内LC3-Ⅱ的表达水平。经DHA (20μM,24h)作用后,通过透射电镜也观察到细胞内自噬泡数量明显增加,而且其中包裹有类似线粒体样内容物。通过Mitotracker Red对线粒体染色,分析LC3蛋白与线粒体的共定位情况,发现DHA作用后两者共定位情况明显增加。2.DHA通过抑制多发性骨髓瘤RPMI8226细胞中NF-κB的激活导致自噬反应发生2.1DHA抑制RPMI8226细胞内NF-κB的活性RPMI8226细胞经DHA (10μM,20μiM,40μM)作用12h后,在全细胞范围内,IκBa蛋白的表达水平明显上调,磷酸化IκBα蛋白水平下调,p65的表达却基本保持不变；在细胞核和细胞质中,DHA分别下调和上调p65蛋白的水平。通过免疫荧光对p65蛋白染色,发现正常细胞内p65弥散分布在细胞核和细胞质中；DHA作用后,p65主要分布在细胞质中。EMSA分析的结果也显示,RPMI8226经DHA(10μM,20μM,40μM)作用12h后,NF-κB结合反应元件的能力逐渐下降。2.2TNF-a逆转DHA抑制RPMI8226细胞内NF-κB活性的作用在全细胞范围内,DHA (20μM)作用12h后分别造成iKBa蛋白累积的增加和磷酸化IKBa蛋白的减少；细胞经TNF-a (20ng/ml,30min)预孵育后,IKBa蛋白和磷酸化IKBa蛋白的水平分别发生下调和上调。在细胞核和细胞质中,DHA单用分别减少和增加p65蛋白的水平；细胞经TNF-a预处理后,p65蛋白的水平分别发生上调和下调。EMSA分析也发现,单用DHA (20μM,12h)可抑制RPMI8226细胞内NF-κB结合反应元件的能力；细胞经TNF-a (20ng/ml,30min)预处理后,NF-κB结合反应元件的能力得到增强。2.3DHA抑制NF-κB活性与诱导自噬反应的时效变化分析时效分析的结果发现,RPMI8226细胞经DHA (20μM)作用12h后,磷酸化κBa蛋白的表达开始减少,同时IKBa蛋白累积增加；另一方面,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达一直到24h才明显上调。2.4TNF-a逆转DHA诱导RPMI8226细胞发生的自噬反应RPMI8226细胞经DHA (20μM,24h)作用后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的表达明显增加,细胞经TNF-a (20ng/mL,30min)预孵育后,DHA诱导的LC3-Ⅱ累积明显减少。另一方面,DHA (20μM,24h)处理可显著增加RPMI8226细胞内自噬泡的数量；细胞经TNF-a (20ng/mL,30min)预孵育后,DHA诱导生成的自噬泡数量明显减少。2.5过表达p65逆转DHA诱导RPMI8226细胞内发生的自噬反应通过慢病毒方法在RPMI8226细胞内表达p65质粒。Western Blot的结果显示,与空白质粒相比,经慢病毒感染的RPMI8226细胞内p65蛋白的表达显著增加。正常RPMI8226细胞和稳定表达p65质粒的RPMI8226细胞经DHA(20μM,12h)作用后,通过核质分离方法分别得到两种细胞的核蛋白,再通过Western Blot方法检测两种细胞核内p65蛋白表达的变化。发现与空白对照组细胞相比,DHA可分别下调两种细胞核内p65蛋白的表达,但是在表达p65质粒的RPMI8226细胞的核内,p65的水平还是较正常细胞显著上调。再通过Western Blot方法检测两种细胞经DHA作用后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达的变化。结果发现,经梯度浓度的DHA (10μM,20μM,40μM)作用后24h后,正常RPMI8226细胞内LC3-Ⅱ蛋白出现累积；反之,在表达p65质粒的RPMI8226细胞内,DHA作用后LC3-Ⅱ蛋白并未出现明显变化。进一步对药物处理后的两种细胞进行AO染色,再通过流式细胞仪定量检测细胞内自噬泡数量的变化。结果发现,经梯度浓度的DHA (10μM,20μM,40μM)作用24h后,正常RPMI8226细胞内,自噬泡数量明显上调；相反,在表达p65质粒的RPMI8226细胞内,自噬泡数量未出现显著变化。3.DHA抑制NF-κB活性导致自噬也发生在早幼粒白血病NB4细胞,结肠癌HCT116细胞和官颈癌Hela细胞中DHA作用于NB4细胞(10μM)、HCT116细胞(5μM)和Hela细胞(5μM)24h后,三株细胞内自噬相关蛋白LC3-Ⅱ均出现累积增加；反之,预孵育TNF-α(20ng/ml,30min)后,DHA诱导LC3-Ⅱ蛋白的表达均出现下调。进一步对DHA处理后的三株细胞进行AO染色,再通过流式细胞仪定量检测细胞内自噬泡数量的变化。结果发现,DHA作用均可导致三株细胞内自噬泡数量的明显增加；反之,预孵育TNF-a后,DHA诱导生成的自噬泡数量均出现下调。4.DHA诱导肿瘤细胞发生自噬与活性氧(ROS)的过度产生有关4.1DHA上调RPMI8226细胞内ROS的水平RPMI8226细胞经DHA (10μM,20μM,40μM)作用15h后,采用DHE染色,再通过流式细胞仪定量检测细胞内ROS的水平。结果发现DHA作用后,细胞内ROS的水平明显发生上调。4.2DHA抑制RPMI8226细胞内FHC和MnSOD的活性Western Blot结果显示,梯度浓度的DHA (10μM,20μM,40μM)作用15h可明显下调RPMI8226细胞内FHC和MnSOD蛋白的表达。再通过试剂盒检测细胞内总SOD的活性,结果发现,经DHA (10μM,20μM,40μpM)处理后的PMI8226细胞内总SOD的活性呈梯度下调。4.3TNF-a逆转DHA抑制RPMI8226细胞内FHC和MnSOD活性的作用DHA(20μM,15h)单用可分别下调细胞内FHC和MnSOD蛋白的表达水平；反之,NF-a (20ng/ml,30min)预处理后,DHA对FHC和MnSOD蛋白表达的抑制作用均有一定程度的逆转。4.4TEMPO逆转DHA诱导肿瘤细胞发生的自噬反应DHA (20μpM,24h)单用可分别导致两株细胞内LC3-Ⅱ蛋白的累积；相反,细胞经TEMPO (2mM,30min)预处理后,DHA诱导LC3-Ⅱ的表达明显减少。进一步通过AO对经DHA和TEMPO处理后的RPMI8226细胞和NB4细胞进行染色,再通过流式细胞仪定量检测两株细胞内自噬泡的数量。结果发现,DHA (20μpM,24h)单用可分别上调两种细胞内自噬泡的数量；反之,TEMPO (2mM,30min)预处理后,两株细胞内DHA诱导生成的自噬泡数量明显减少。5.DHA诱导RPMI8226细胞发生凋亡与NF-kB活性被抑制有关PI单染的结果显示,RPMI8226细胞经DHA (20μM)作用24小时后,凋亡率明显增加。细胞预孵育TNF-a (20ng/mL,30min)后,再用DHA处理,凋亡率显著减少。上述研究结果表明,①DHA诱导自噬反应主要是通过抑制肿瘤细胞内NF-κB活性引起的；②抑制NF-κB活性的作用是通过抑制IκBα蛋白的磷酸化降解,导致IκBα蛋白累积,从而阻滞p65的核转位而实现的；③抑制NF-κB活性造成下游调控细胞内ROS水平的关键酶类FHC和MnSOD的表达减少,从而上调ROS水平,并进一步引发自噬反应。结论：二氢青蒿素诱导肿瘤细胞发生自噬主要是通过抑制NF-κB通路实现的,此过程与ROS的过度产生有关。