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研究背景B-RAF基因属于RAF基因家族，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，将信号从RAS转导至ERK，从而参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化及凋亡等。科研人员已在人类许多肿瘤组织中都发现B-RAF基因的突变，如70%的皮肤癌，50%的甲状腺癌，20%的结肠癌等恶性肿瘤中都检测到B-RAF基因的突变。其中大约90%的点突变为T1796A，该点突变导致缬氨酸被谷氨酸所代替（V600E），称为B-RAFV600E。本课题组崔永萍教授在美国期间首次发现了B-RAF基因在有丝分裂期的新作用，该基因突变后可导致人皮肤癌细胞、黑色素细胞和永生化上皮细胞出现纺锤体异常、染色体不稳定性及非整倍体细胞出现。在此基础上又鉴定出癌基因B-RAFV600E新的作用底物—纺锤体检测点激酶Mps1，二者在有丝分裂期均定位于着丝粒和中心体处，B-RAFV600E主要通过增强Mps1的稳定性而使Mps1蛋白水平以及激酶活性显著增加，导致纺锤体检测点过度激活。但是，B-RAFV600E如何调控Mps1蛋白稳定性的分子机制目前还不清楚。目的明确B-RAFV600E调控Mps1蛋白稳定性的分子机制。方法为了明确B-RAFV600E如何调控Mps1蛋白稳定性的分子机制，我们主要从以下几方面进行研究：（1）通过体内泛素化实验明确B-RAFV600E对Mps1蛋白泛素化降解过程的影响。（2）LC-MS/MS鉴定Mps1上B-RAFV600E特异性磷酸化位点，应用传统候选基因研究法进一步明确M ps1上相应B-RAFV600E磷酸化位点对Mps1蛋白稳定性的影响。结果（1）体内泛素化实验结果显示：与未表达B-RAFV600E的细胞相比，表达B-RafV600E的细胞泛素-Mps1蛋白复合物水平显著降低，并导致过量Mps1蛋白聚积于中心体。（2）LC-MS/MS鉴定出Mps1上存在三个B-RAFV600E特异性磷酸化位点S281、S436、S821。（3）因前期报道过pS821-Mps1相关研究。因此，本研究将关注pS281-Mps1、pS436-Mps1对Mps1蛋白稳定性的影响。构建Mps1蛋白相应磷酸化位点突变体，观察其对Mps1稳定性的影响。①结果发现S281E组Mps1蛋白异常稳定，而WT-Mps1与其他突变体对Mps1蛋白稳定性无明显影响。在Cdc20过表达细胞中野生型Mps1、Mps1-S281A/E、S436A/E三组中Mps1蛋白都明显降解，S281E的Mps1蛋白水平无明显改变。提示：pS281-Mps1抑制Mps1经APC/CCdc20介导的泛素化降解过程。②免疫共沉淀实验表明：在表达WT-Mps1、Mps1-S281A、S436 A/E细胞中，Mps1与Cdc27免疫沉淀物中分别检测到Cdc27与Mps1，在表达S281E细胞中，Mps1与Cdc27无相互作用。进一步Westernblot分析发现：与S281A、S436A/E及S821A/E相比，S281E显著抑制Mps1泛素化水平。提示：p-S281Mps1通过阻止Mps1与Cdc27结合而抑制Mps1蛋白的泛素化作用。③免疫荧光分析发现：表达GFP-S436E、GFP-S821A/E与表达野生型Mps1的细胞中Mps1信号强度无明显差异。表达GFP-S281E的细胞中心体处GFP信号明显增强。结论综合以上结果表明，B-RAFV600E通过磷酸化修饰Mps1-S281抑制Mps1泛素化降解而增强其稳定性，导致过量Mps1蛋白在中心体处聚积。