海马区是大脑的重要组成部分,参与调节了短期记忆、学习、认知及情绪等多种生理功能。海马神经元是海马区的主要成分,其表面分布着各种重要的功能性受体,当这些受体与相应配体作用后会传导生物信号,从而影响学习、记忆等各种重要的神经活动。当前,如何深入、完整理解受体和配体之间的识别作用及作用过程中的生物、物理机制已成为人们关注的一个热点。对这些问题的深入认识需要从单分子水平开展研究工作。目前传统的检测方法只能对受体与配体的作用进行统计分析,得到受体与配体相互作用的平均信息,难以在单分子层面对其进行精确的认识。基于原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)的单分子力谱技术的出现弥补了这一空白。AFM单分子力谱技术已经开始被用于细胞表面受体识别作用的研究,但是将这种技术应用于神经细胞表面受体识别研究还处在起步阶段,需要对其进一步发展。海马神经元表面分布了许多受体,比如酪氨酸激酶受体B(Receptor tyrosine kinase B,TrkB),N-甲基-D-天冬氨酸-型谷氨酸(N-methyl-D-aspartate-type glutamate receptors,NMDA)受体和γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid B,GABA B)受体等,其中TrkB受体是海马神经元表面的一种重要受体,该受体与脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)有高度的特异性。它们之间的相互作用对海马神经元的功能发挥具有非常重要的作用。本课题将以海马神经细胞表面的TrkB受体和BDNF分子为研究对象,以AFM力学检测技术为研究手段,旨在建立一种可用于该体系检测的单分子力谱技术。首先,我们建立了海马神经元培养体系。我们选用刚出生的乳鼠作为实验对象,解剖分离出乳鼠的海马组织,经过消化和培养后,成功得到了海马神经元的原代细胞。然后利用AFM高分辨率成像技术,对培养成熟的神经元进行了AFM成像,获得了海马神经元的细胞形貌信息。接着,我们采用了化学修饰方法将α,ω-二羧基聚乙二醇(HOOC-PEG3500-COOH)分子的一端通过羧基连接到AFM探针上,再将另一端羧基与无机金基底的氨基作用进行单分子力谱检测。对单分子力谱数据进行拟合和统计分析后,我们得到α,ω-二羧基聚乙二醇分子脱离基底的作用力大小为102.90±7.03 pN;α,ω-二羧基聚乙二醇分子长度为17.96±0.93 nm[自由连接链模型(Freely jointed chain,FJC)拟合]和19.40±1.68 nm[蠕虫链模型(Worm-like chain,WLC)拟合]。所测到的α,ω-二羧基聚乙二醇与金基底作用力大小以及其长度均与对应的理论值相吻合。上述实验证明,我们成功地将α,ω-二羧基聚乙二醇分子连接在了AFM探针上,为进一步将BDNF蛋白连接在AFM探针上奠定了基础。完成上述工作后,我们研究了海马神经细胞膜表面TrkB受体与BDNF蛋白识别的单分子力谱。先将BDNF蛋白通过α,ω-二羧基聚乙二醇分子的另一个末端连接到AFM探针,再通过AFM力学测量技术将修饰蛋白的探针与海马神经元表面TrkB受体作用,开展单分子力谱识别实验。对单分子力谱数据进行拟合和统计分析后,我们得到BDNF蛋白与TrkB受体作用解离作用力大小为206.81±8.13 pN,该数值处于受体与配体作用力范围之内;α,ω-二羧基聚乙二醇与BDNF蛋白连接复合物的长度为25.34±1.21 nm(FJC模型)和26.56±1.52 nm(WLC模型),这些实验得到的长度数值与α,ω-二羧基聚乙二醇与BDNF蛋白连接形成的复合物的的理论值相吻合。上述实验证明,我们将BDNF蛋白连接到了AFM探针上,成功地利用BDNF对海马神经元表面TrkB受体在单分子水平进行了识别。综上所述,我们发展了海马神经元培养体系,将BDNF蛋白通过α,ω-二羧基聚乙二醇修饰到了AFM探针,研究了海马神经细胞膜表面TrkB受体与BDNF蛋白的识别作用,成功建立神经细胞膜表面受体识别的单分子力谱方法。该工作为进一步深入研究神经元表面受体与配体之间相互作用的生物物理机制奠定了技术基础。