论文部分内容阅读
目的:验证我们之前研究证明的sno RD126上调FGFR2对PI3K-AKT通路的激活作用,进一步探索sno RD126上调FGFR2的机制,探索sno RD126发挥促癌功能的关键结构域,进一步揭露sno RD126在肝癌发生发展中的作用。探究ASO在体内体外抑制sno RD126的促癌作用,探讨ASO作为新的肝癌治疗药物的可能性。方法:使用分子克隆技术构建sno RD126过表达的稳系,q RT-PCR技术检测sno RD126的表达量,WB实验检测PI3K-AKT通路是否被激活或者抑制,使用RNA-pull down技术下拉蛋白做质谱分析,并在质谱结果中挑选代表性的可能结合蛋白联合使用RNA-pull down和western blot（WB）技术验证质谱结果。通过对sno RD126的C box,D box,C’box和D’box进行点突变,用突变后的sno RD126制作探针,再去下拉蛋白,然后WB验证。最后锁定了蛋白hn RNPK,然后再使用RIP实验反向验证hn RNPK和sno RD126及结构域突变后的sno RD126的结合,看看结构域突变后与蛋白的结合是否会受影响。构建sno RD126的C’和D结构域单突变和联合突变的细胞系,利用CCK8、平板克隆和Ed U检测处理后的细胞的增殖效应,q RT-PCR实验检测FGFR2的转录水平,Western blot实验检测细胞处理后的PI3K-AKT通路是否被激活,利用Ch IP实验检测sno RD126和hn RNPK蛋白复合体对FGFR2的转录水平的调控是否是转录调控。双荧光素酶报告基因实验更进一步说明了这点。在肝癌细胞上转染靶向sno RD126的ASO后,用CCK8和平板克隆实验评价ASO处理后对肝癌细胞增殖的影响。之后在体内进一步验证这个结果,即先用人源性的肝癌细胞打在裸鼠皮下,成瘤后再瘤内注射一定浓度的ASO,最后肿瘤组织称重,组化或者Western blot等试验检测细胞增殖标志物Ki67和PI3K-AKT通路的磷酸化水平。连续选取2016年5月至2017年8月之间在华中科技大学同济医学院附属同济医院肝脏外科中心手术切除的肝癌组织和匹配的癌旁无肿瘤的肝组织68例,结合肝癌临床病理因素及预后进行分析。结果:在Huh7细胞系过表达sno RD126后,FGFR2的转录水平升高,PI3K-AKT通路激活,在Hep G2细胞系中敲减sno RD126后,FGFR2的转录水平降低,并且PI3K-AKT通路受到抑制。在突变后的sno RD126探针下拉的蛋白进行WB实验检测,结果中可以看出C’box突变和D box突变组,hn RNPK和PRPF8蛋白条带明显变淡,并且hn RNPK变化更明显。在野生型的Hep G2和过表达野生型和突变体的sno RD126huh7细胞系中进行RIP实验,实验结果进一步证实hn RNPK和sno RD126的结合。通过CCK8、平板克隆和Ed U实验,我们发现野生型的sno RD126促进增殖效应很明显,但是当sno RD126的的C’和D结构域突变后,sno RD126的促进增殖效应消失,将蛋白hn RNPK敲减后,我们发现肝癌的增殖效应受到抑制。在sno RD126上调的时候,将hn RNPK敲低,sno RD126的促增殖效应消失。在野生型的Hep G2细胞中敲减hn RNPK蛋白,FGFR2的转录水平降低,不仅如此,在sno RD126上调的Huh7细胞中,敲减hn RNPK,本该上调的FGFR2也会受到抑制。Western blot实验实验也说明了将sno RD126敲减,PI3K-AKT通路明显受到抑制,将hn RNPK蛋白敲减,PI3K-AKT通路明显受到抑制,在在sno RD126上调的Huh7细胞中,敲减hn RNPK,本该被激活的PI3K-AKT通路也会受到抑制。Ch IP实验可以发现hn RNPK可以结合到FGFR2启动子0--500bp的区域,我们后续的双荧光素酶报告基因实验验证了这一个结果。sno RD126的的C’和D结构域突变后,sno RD126在体内的促进肿瘤细胞增殖的能力受到抑制。通过CCK8、平板克隆实验,我们发现ASO抑制sno RD126的促增值效应很明显,体内实验发现ASO可以抑制sno RD126的促癌效应。肝癌病人的癌与癌旁组织对比,通过q RT-PCR检测sno RD126的表达量,sno RD126在肝癌组织中主要呈高表达,并且sno RD126高表达的病人往往具有较低的总体生存率。结论:sno RD126通过其结构域C’和D与蛋白hn RNPK结合并发挥促癌功能,转录上调FGFR2,并激活PI3K-AKT通路,促进肝癌增殖。ASO在体内体外抑制sno RD126的促癌作用,这提示ASO可作为治疗肝癌的潜在治疗药物,sno RD126在肝癌中多呈高表达,且高表达sno RD126的肝癌病人往往具有较差的预后。