研究背景:血管钙化是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）患者中最常见的病理现象。现有的证据表明血管钙化与CKD患者心血管事件风险显著相关,是CKD患者心血管并发症的独立危险因素。然而目前临床尚无针对CKD患者血管钙化的有效预防和治疗方法。近年来,越来越多的证据表明肠道菌群在多种疾病中扮演着关键性角色,包括CKD。肠道菌群失衡,即肠道微生物组成和功能的改变是CKD患者的一个显著特征。一方面,肠道菌群失衡引起肠道屏障损伤,进而引起内毒素血症以及CKD患者全身炎症状态,促进CKD患者血管钙化的进展。另一方面,肠道菌群的改变通过影响氨基酸以及胆碱等的代谢,调节尿毒症毒素如氧化三甲胺（Trimethylamine oxide,TMAO）、对甲酚等的产生,加重CKD患者血管钙化风险。调节肠道菌群、保护肠道屏障、抗炎等是预防和治疗CKD患者血管钙化的新方向。补充益生菌作为调节肠道菌群、保护肠屏障、抗炎最简便有效的方式,是目前预防和治疗疾病的潜在有效策略。益生菌现已被广泛应用于尝试保护CKD患者肾功能并降低尿毒症毒素的产生,然而多项研究表明多株益生菌均具有显著的促进骨形成效应。众所周知,血管钙化是一个积极主动的调节过程,与骨形成具有相似的病理组织学特征和起始机制,同时血管钙化与骨形成共用多条相同信号通路,靶向骨形成可能会影响CKD患者血管钙化进程。遗憾的是目前尚无关于益生菌影响CKD患者血管钙化的报道。鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG,LGG）是目前研究最为广泛且最具有临床应用前景的益生菌之一,由Gorbach和Goldin于1985年从一名健康志愿者粪便样本中分离,具有抗炎抗氧化应激保护肠屏障等多种功效。然而一项体内研究表明LGG能够通过treg细胞介导的WNT10B表达来刺激骨形成。LGG能否影响CKD患者血管钙化进程尚不清楚。研究目的:本研究旨在探究补充益生菌LGG对CKD相关血管钙化进程的影响及其潜在机制,进而为CKD患者正确使用益生菌提供参考。研究方法与结果:1、首先我们运用5/6肾切模型诱导大鼠肾衰,2周后测量大鼠血清肌酐水平判断CKD模型是否建立成功,随后我们采用高磷饮食联合VitD3诱导CKD大鼠血管钙化,同时灌胃补充LGG来探究LGG对CKD大鼠血管钙化的影响。LGG组大鼠灌菌剂量为1×109 CFU/Kg/day。结果显示和Model组相比,LGG的补充显著促进了 CKD大鼠的体重丢失。主动脉茜素红染色、Micro-CT以及血管切片结果均显示LGG的补充显著促进了 CKD大鼠的血管钙化。Western blot结果证实外源性补充LGG提高了成骨转录因子Runx2的表达。这些结果表明益生菌LGG能够显著促进CKD大鼠的血管钙化。2、随后采用16sRNA测序分析LGG的补充对CKD大鼠肠道菌群的影响。肠道菌群组成分析显示在科水平上,LGG的补充显著促进了乳杆菌科在CKD大鼠的富集。同样的在属水平上LGG的补充显著促进了乳杆菌属的富集。线性判别分析表明LGG的补充显著改变了 CKD大鼠的肠道微生物群,其中乳杆菌的丰度在三组之间存在显著的差异。Spearman相关分析表明Runx2的表达与乳杆菌水平存在显著正相关,这一结果表明LGG能够在大鼠肠道中定植且可能与促进CKD大鼠血管钙化效应直接相关。3、采用超高速离心法提取LGG分泌的EVs并探究其对血管钙化的影响。在钙化培养基中我们分别采用4 μg/ml,8 μg/ml,16 μg/ml三个浓度的EVs来处理大鼠血管平滑肌细胞。茜素红染色、钙定量结果表明LGG来源的EVs以浓度依赖的方式促进大鼠血管平滑肌钙化,q-pcr以及Western Blot结果表明EVs明显上调了 Runx2和BMP2的表达,显著促进了血管平滑肌细胞的成骨样表型转化。同样的我们发现EVs在体外高磷高钙环境下能够促进离体主动脉血管环的钙化。体内实验表明EVs同样促进了 CKD大鼠血管钙化。以上结果表明LGG通过分泌EVs促进CKD大鼠血管钙化。4、随后Western Blot结果表明LGG以及EVs的补充均激活了 CKD大鼠体内PI3K/AKT信号通路。体外细胞实验同样表明LGG来源的EVs以浓度依赖的方式激活大鼠平滑肌细胞中PI3K/AKT信号通路。研究结论:本研究首次证实鼠李糖乳杆菌GG（LGG）及其来源的EVs能够促进CKD大鼠血管钙化,且这一效果与PI3K/AKT信号通路的激活有关。CKD患者或许应当谨慎使用特定益生菌菌株,例如LGG。