论文部分内容阅读
目的钠稳态异常与侵袭性肿瘤的多个方面都密切相关,并且渗透压转录因子Ton EBP/NFAT5被鉴定为迁移和侵袭的重要调节因子,故我们课题组探讨高钠激活Ton EBP的分子机制对胶质瘤发生发展的潜在影响,从而发现新的治疗靶点,为胶质瘤的研究提供新的诊断和治疗方向。方法1.胶质瘤病人标本收集,通过IHC染色和Western blot分析Ton EBP表达情况,比较癌旁组织和肿瘤标本中Ton EBP表达情况。Kaplan-Meier分析高低Ton EBP与患者预后不良的关系。2.探究Ton EBP和Na离子对胶质瘤LN229、U251细胞的迁移和侵袭能力的影响。体内环境3D凝胶模拟探究Ton EBP和Na离子对胶质瘤LN229、U251细胞侵袭能力的影响。High-throughput m RNA microarray和KEGG分析Ton EBP下游信号通路。3.银染质谱鉴定与Ton EBP相互作用的蛋白分子,利用免疫共沉淀(Co-IP)实验和PLA(Proximity Ligation Assay)实验进行进一步的验证;Co-IP和核浆分离实验验证Na Cl对Ton EBP核浆分布的影响;荧光素酶和q-PCR实验检测Ton EBP的转录活性。4.采用小鼠原位模型研究Ton EBP信号转导在体内的作用。免疫组化、免疫荧光及Western blot分析不同分级胶质瘤患者组织Ton EBP和相关蛋白的表达。结果1.胶质瘤中Ton EBP表达与恶性程度密切相关。肿瘤标本中Ton EBP水平明显高于正常脑组织,而且Ton EBP表达随胶质瘤病理级别的升高而升高,Ton EBP与胶质瘤患者预后不良呈正相关。2.为了分析Ton EBP在胶质瘤当中发挥的作用,利用银染质谱鉴定与Ton EBP相关的蛋白质-EZH2,为了确定EZH2与Ton EBP能否发生作用,我们在细胞和组织通过Co-IP和PLA实验发现二者可结合。Western blot结果分析发现敲低EZH2或加入EZH2抑制剂DZNep之后降低Ton EBP的核定位。荧光素酶报告实验和q-PCR进行Ton EBP靶基因测定,敲低EZH2或加入EZH2抑制剂DZNep之后降低Ton EBP转录活性,表明EZH2在Ton EBP发挥转录因子功能时发挥十分重要的作用。3.组蛋白甲基转移酶EZH2是特异性的H3K27的甲基转移酶。首先通过CHIP分析发现EZH2在此不发挥转录抑制的作用。并且EZH2能作为转录激活因子使转录因子发生甲基化,我们利用免疫共沉淀实验发现Ton EBP在胶质瘤中存在甲基化,Na Cl能增强EZH2与Ton EBP的相互作用以及Ton EBP的甲基化,敲低EZH2或加入EZH2抑制剂DZNep之后降低Ton EBP的甲基化。同时EZH2的S21位点磷酸化在其发挥转录共激活因子中是十分重要的,所以进行S21位点突变之后发现EZH2-S21A降低Ton EBP的甲基化。核浆分离实验及免疫荧光分析发现S21位点磷酸化增强Ton EBP的核转位。通过q-PCR检测Ton EBP靶基因m RNA表达以及荧光素酶报告实验发现S21A降低Ton EBP转录活性。4.通过每周的小动物生物发光成像发现,Sg-Ton EBP细胞能够抑制肿瘤体内生长,然而EZH2-WT有效恢复了Sg-Ton EBP诱导的肿瘤生长抑制,而EZH2-S21A作用并不明显。5.不同分级胶质瘤患者的肿瘤标本,通过组织提取发现存在Ton EBP自身甲基化,Ton EBP甲基化随着组织学等级的增高而增加。临床标本通过免疫组化染色,发现p-EZH2(S21)在低级别胶质瘤中定位于细胞核,而p-EZH2(S21)在GBM的细胞质中能检测到,EZH2的染色强度随着临床级别升高而增强。结论1.EZH2与Ton EBP相互结合,通过赖氨酸甲基化激活其活性2.高钠激活EZH2 S21位点磷酸化介导Ton EBP甲基化