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目的呼吸道合胞病毒(RSV)感染可以引起儿童急性脑病,导致神经系统症状,但尚未阐明其确切的致病机制。TLR4和核仁素两种受体都可以介导吸道合胞病毒感染中枢神经元。本课题的目的是研究这两种受体在RSV感染中枢神经元中可能的协同作用,为今后临床治疗以及疾病预防提供新的思路。方法实验用TLR4与C23过表达质粒转染293T细胞后,激光共聚焦和免疫共沉淀检测它们的共定位和相互作用情况;然后,以TLR4和C23的过表达质粒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y,简称SY5Y)细胞,再行RSV感染,以未行任何处理的细胞为正常对照组,并分别设立RSV感染组、TLR4过表达组、C23过表达组、TLR4+C23过表达组。在RSV感染2h、4h、24h、48h后分别从每个组收集蛋白以及细胞的上清液。(1)免疫印迹法(Western-blot)检测各组不同时间点p-NF-κB,TLR4及C23蛋白水平的表达变化;(2)实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)在每一组不同时间点检测TLR4和C23 m RNA表达的变化;(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养液上清中IL-6、IL-8和TNF-α含量的改变情况;(4)流式细胞术检测每组细胞凋亡率。结果(1)激光共聚焦和免疫共沉淀结果显示:用TLR4和C23过表达质粒分别转染293T细胞后,激光共聚焦观察到细胞表面存在共定位;收集细胞用相应抗体孵育处理,进行免疫共沉淀反应后,免疫印迹检测相应蛋白表达的情况显示:用C23蛋白抗体孵育结合后可以下拉到TLR4,且TLR4蛋白抗体孵育结合后也下拉出C23蛋白。提示TLR4和C23存在相互作用。(2)Western Blot结果显示:在正常对照组中,p-NF-κB蛋白的表达量较低,经RSV病毒感染之后,随着感染时间增加蛋白表达量不断增加;与RSV感染组相比,TLR4过表达组、C23过表达组,TLR4+C23过表达组的p-NF-κB表达量均有所增加,其中TLR4过表达组相对于同时间点的C23过表达组增加的更明显,而且TLR4+C23过表达组的p-NF-κB表达量最高,差异从2h开始具有显著统计学意义(P<0.05)。TLR4蛋白在正常对照组中表达量较低,RSV感染后表达上升,2h开始差异有统计学意义(P<0.05);与RSV感染组相比,TLR4过表达组、C23过表达组,TLR4+C23过表达组的表达量均有所增加,同时间点TLR4+C23过表达组中的表达量显著高于单独过表达组。C23蛋白在各组细胞中的变化也检测到类似的结果。(3)Real-time PCR结果显示:正常细胞中TLR4 m RNA含量较低,RSV感染后TLR4 m RNA表达上升,2h开始差异有统计学意义(P<0.05);与RSV感染组相比,TLR4过表达组、C23过表达组中表达量都显著升高;其中,TLR4+C23过表达组的表达量最高,差异从2h开始具有显著统计学意义差异(P<0.01)。C23 m RNA的表达检测到与TLR4 m RNA类似的结果。(4)ELISA结果显示:正常对照组中IL-6、IL-8和TNF-α表达量较低,经RSV感染后,SY5Y细胞培养上清液中的IL-6、IL-8和TNF-α的含量,随着感染时间的延长不断升高,均高于对照组,具有统计学意义(P<0.05)。TLR4过表达组、C23过表达组中IL-6、IL-8和TNF-α表达量显著升高(P<0.01),且TLR4过表达组升高更明显,其中,TLR4+C23过表达组的表达量最高。差异有显著性(P<0.05)。(5)流式细胞术结果显示:正常组SY5Y细胞凋亡较少;RSV作用24 h后,RSV感染组细胞凋亡增加,凋亡有统计学意义(P<0.01);TLR4过表达组、C23过表达组与RSV组相比,细胞凋亡较为明显升高,与RSV组相比凋亡有统计学意义(P<0.01);TLR4+C23过表达组与RSV组相比细胞凋亡变化更为明显,具有显著统计学意义(P<0.01)。在感染后48 h,各组细胞凋亡检测到与24h相似的表达趋势,但均比24h时增加的更加显著。结论TLR4和C23可以相互作用共同促进RSV活化NF-κB,导致相关信号通路下游细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α表达增高和细胞凋亡,表明两受体在RSV感染SY5Y细胞所致损伤中起到协同作用。