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植物内生真菌指的是其生活史中有一部分生活在健康植株体内,并且没有引起宿主明显病害症状的真菌。这类微生物在与宿主共生的特殊环境中能够产生大量结构新颖且活性显著的天然产物,具有很高的研究价值。丹参是一种传统的中药材,具有活血化瘀,凉血消痈,抗炎保肝,抗肿瘤,清除自由基等多种功效,常用于心脑血管疾病、急性缺血性中风、高血脂和炎症的治疗当中,是使用最广泛的药材之一。基于此,本研究选择药用植物丹参作为研究对象,利用现代微生物分离技术从中分离和鉴定内生真菌,并对三株目标菌株发酵提取物进行化学成分和生物活性研究,以期从中发现一批结构新颖且活性显著的天然产物,为新药研发提供基础。主要研究内容如下:
①丹参内生真菌的分离、纯化和鉴定:利用现代微生物分离技术从丹参中共分离得到18株内生真菌菌株,采用分子生物学技术将其分别被鉴定为Colletotrichum truncatum,Fusarium proliferatum,Sclerotinia sp.Albifimbria terrestris,Fusarium oxysporum,Edenia gomezpompae,Colletotrichum spaethianum,Alternaria alternata,Aspergillus flavus,Corynespora cassiicola,Talaromyces pinophilus,Didymella Americana,Aspergillus assiutensis,Penicillium crustosum,Chaetomium globosum,Colletotrichum gloeosporioides,Alternaria burnsii,Cladosporium cladosporioides。通过文献检索,从中发现3株内生真菌(Talaromyces pinophilus,Chaetomium globosum,Colletotrichum gloeosporioides)具有进一步研究价值。
②3株丹参内生真菌的化学成分研究:采用OSMAC策略对3株目标研究菌株进行筛选,选取出代谢产物最丰富的一种培养基进行大规模发酵。然后利用天然产物研究手段对发酵培养物进行化学成分研究,运用现代波谱分析对分离得到的化合物进行化学结构鉴定。从3株丹参内生真菌的发酵产物中共分离得到30个单体化合物(包括6个新化合物)。具体研究结果如下:①从Talaromyces pinophilus发酵产物中共分离得到9个单体化合物,包括1个萜类化合物(1),1个多烯类化合物(2),7个其他小分子化合物(3-9),化合物1和2为新化合物;②从Chaetomium globosum发酵产物中共分离得到13个单体化合物,包括4个酮类化合物(10-13),6个生物碱类化合物(14-19),3个甾体类化合物(20-22),化合物10和11为新化合物;③从Colletotrichum gloeosporioides发酵产物中共分离得到8个单体化合物,包括2个萜类化合物(23-24),3个生物碱类化合物(25,26,29),1个甾体类化合物(28),1个有机酸类化合物(30),化合物23和24为新化合物。
③生物活性筛选:对以上分离得到的化合物进行抗农作物病原真菌、人类致病细菌和细胞毒活性研究。研究结果表明:①化合物1,2,4,14,15和16具有不同程度抗农作物病原真菌活性,其中化合物14活性最为显著(MIC值达到3.13-25μg/mL);②化合物1,2,4,5,8和9对敏感性细菌具有一定活性,化合物14对临床耐药性细菌具有显著抑制活性(MIC值为3.13-6.25μg/mL),其活性与阳性对照相当;③化合物15和16对人体肿瘤细胞株具有显著抑制活性。
①丹参内生真菌的分离、纯化和鉴定:利用现代微生物分离技术从丹参中共分离得到18株内生真菌菌株,采用分子生物学技术将其分别被鉴定为Colletotrichum truncatum,Fusarium proliferatum,Sclerotinia sp.Albifimbria terrestris,Fusarium oxysporum,Edenia gomezpompae,Colletotrichum spaethianum,Alternaria alternata,Aspergillus flavus,Corynespora cassiicola,Talaromyces pinophilus,Didymella Americana,Aspergillus assiutensis,Penicillium crustosum,Chaetomium globosum,Colletotrichum gloeosporioides,Alternaria burnsii,Cladosporium cladosporioides。通过文献检索,从中发现3株内生真菌(Talaromyces pinophilus,Chaetomium globosum,Colletotrichum gloeosporioides)具有进一步研究价值。
②3株丹参内生真菌的化学成分研究:采用OSMAC策略对3株目标研究菌株进行筛选,选取出代谢产物最丰富的一种培养基进行大规模发酵。然后利用天然产物研究手段对发酵培养物进行化学成分研究,运用现代波谱分析对分离得到的化合物进行化学结构鉴定。从3株丹参内生真菌的发酵产物中共分离得到30个单体化合物(包括6个新化合物)。具体研究结果如下:①从Talaromyces pinophilus发酵产物中共分离得到9个单体化合物,包括1个萜类化合物(1),1个多烯类化合物(2),7个其他小分子化合物(3-9),化合物1和2为新化合物;②从Chaetomium globosum发酵产物中共分离得到13个单体化合物,包括4个酮类化合物(10-13),6个生物碱类化合物(14-19),3个甾体类化合物(20-22),化合物10和11为新化合物;③从Colletotrichum gloeosporioides发酵产物中共分离得到8个单体化合物,包括2个萜类化合物(23-24),3个生物碱类化合物(25,26,29),1个甾体类化合物(28),1个有机酸类化合物(30),化合物23和24为新化合物。
③生物活性筛选:对以上分离得到的化合物进行抗农作物病原真菌、人类致病细菌和细胞毒活性研究。研究结果表明:①化合物1,2,4,14,15和16具有不同程度抗农作物病原真菌活性,其中化合物14活性最为显著(MIC值达到3.13-25μg/mL);②化合物1,2,4,5,8和9对敏感性细菌具有一定活性,化合物14对临床耐药性细菌具有显著抑制活性(MIC值为3.13-6.25μg/mL),其活性与阳性对照相当;③化合物15和16对人体肿瘤细胞株具有显著抑制活性。