由弓形虫引起的弓形虫病呈世界范围内分布,通常呈隐形感染,但在免疫力低下人群,如肿瘤、艾滋病、器官移植等患者更易受弓形虫感染,引起全身功能性损伤,孕期女性感染弓形虫导致胎儿发育畸形,严重者导致胎儿死亡。猪、牛、羊等家畜感染弓形虫后其生产性能下降,影响农业经济发展。弓形虫病临床上尚没有安全、有效、无副作用的治疗药物,因此,弓形虫药物靶点的鉴定对于弓形虫病防控具有重要意义。酪蛋白激酶(casein kinase,CK)是一类调节细胞生命过程的丝/苏氨酸激酶家族,该酶可以催化自身或底物磷酸化。CK1倾向于先磷酸化底物,再与其它蛋白激酶协作完成信号通路过程。根据蛋白活性不同分为I型和II型两种酪蛋白激酶,其中CK1包含CK1α,CK1β,CK1γ1,CK1γ2,CK1γ3,CK1δ和CK1ε七种异构体,在真核细胞中均高度保守。研究表明CK1β参与Wnt信号传导、膜运输、细胞骨架修复、DNA复制和RNA新陈代谢等生理过程,还与肿瘤的发生发展相关,所以成为药物研发的重要靶标。(1)TgCK1β原核表达通过RT-PCR技术克隆弓形虫CK1βcDNA,构建原核表达载体p ET-22b-CK1β,重组蛋白经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-bolt分析,分子量为49 k Da。重组蛋白经Ni-NTA纯化和浓缩后浓度达1 mg/m L,纯度高达90%以上。将重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价达1:12800,运用IFA检测CK1β在弓形虫体内表达部位,表明CK1β主要在弓形虫细胞膜上。(2)Tg CK1β缺失株构建利用PCR技术扩增Tg CK1β非编码序列,分别克隆至弓形虫抗性基因腐草霉素(phle)表达盒的上下游,构建重组基因打靶载体。利用电转染技术将线性化重组质粒导入弓形虫野生株,构建弓形虫CK1β基因打靶载体,通过药物筛选获得弓形虫CK1β缺失虫株;筛选出的虫株经PCR及Southtern blot方法鉴定,结果表明缺失株构建成功。上述试验均为研究弓形虫CK1β缺失株对细胞粘附、侵入和增殖等生物学特性及功能研究奠定基础。