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杂合抗菌肽是利用基因重组技术使不同的抗菌肽片段连接组合,构建出新型的抗菌肽。构建新型杂合抗菌肽是对天然抗菌肽优化改造的重要方法之一。杂合抗菌肽不仅克服了天然抗菌肽的缺陷,还将其各自的优点集于一体,极大地提高了抗菌肽的生物活性,是目前应用研究的热点。本研究利用基因工程及分子生物学技术,对人工设计合成的杂合抗菌肽Sα-Jp基因进行克隆和真核表达;优化表达条件,并研究分离提纯后表达产物的生物学活性和理化特性,研究的主要结果如下:1、杂合抗菌肽Sα-Jp基因的克隆:依据Spinigerinα、JaponicinⅡ的氨基酸排列序列,以及Pichia pastoris偏爱密码子优化设计杂合抗菌肽Sα-Jp基因序列并设计引物,采用PCR扩增技术成功的合成出杂合抗菌肽Sα-Jp基因。将Sα-Jp基因克隆至质粒pPICZαA中,构建出重组表达载体pPICZαA-Sα-Jp。重组质粒经大小、双酶切和PCR扩增及DNA序列鉴定,证明已成功构建出真核表达载体pPICZαA-Sα-Jp。2、杂合抗菌肽Sα-Jp基因的表达:重组质粒用SacI线性化后电击转化至Pichia pastorisGS115宿主菌中。用Zeocin(博来霉素)筛选出阳性高拷贝的转化子。将鉴定正确的转化菌GS115-Sα-Jp在BMMY诱导培养基中进行甲醇诱导表达。采用Bradford法测量表达上清液中目的蛋白的含量。结果表明,杂合抗菌肽Sα-Jp在诱导96h表达量达到峰值10.7 mg/L。诱导表达的上清经镍分离柱提纯后进行蛋白质SDS-PAGE电泳,约在5.0kD处有蛋白条带,和预期相符合。3、表达条件的优化:通过对诱导条件的优化,筛选出最佳的表达条件:诱导时间96h、诱导温度28℃、每24h追加甲醇体积浓度0.5%、培养基的初始pH为6。在此最佳条件下诱导,杂合抗菌肽Sα-Jp的含量可达13.6 mg/L。4、生物活性和理化特性研究:杂合抗菌肽Sα-Jp对E.coli、S.aureus、肠炎沙门氏菌等均有抑菌作用,最小抑菌浓度分别为为0.100mg/mL、0.160mg/mL、0.140mg/mL;其中对大肠DH5α的作用较强,抑菌直径可达23.2mm;但对黑曲霉、啤酒酵母菌没有抗菌作用。有较好的耐热性,经100℃、25min处理后仍具有抗菌性。耐受性好,在pH为3-10时均有抗菌性,且在pH为6-7时抗菌活性较好。经紫外线照射1h处理后仍具有良好的活性。遗传稳定性好,在传代50次后,目的基因未发生丢失,表达产物仍具有良好的抑菌活性。